miR-196a高表达在肾脏损伤中作用的分子生物学机制

李慧聪

(河南大学淮河医院，河南 开封 475000)

慢性肾脏损伤中肾小管间质纤维化是共同病理特征，在原发性或继发性肾脏疾病中，肾小管间质纤维化程度是决定肾功能恶化水平的主要因素〔1〕。因此，早期抑制或逆转肾小管间质纤维化对延缓肾脏损伤向终末期发展具有重要意义。肾间质肌成纤维细胞是构成胞外基质的主要细胞，肾小管上皮间充质转分化是病理状态下肌成纤维细胞增多的主要机制之一〔2，3〕。相关研究显示，肾小管间质纤维化过程中肾小管上皮间充质转分化发挥重要作用，该过程在一定条件下具有可逆性〔4〕。但目前肾小管间质纤维化的相关调控机制仍未明确，尚缺少有效的干预靶点。近年来研究发现miR-196a不仅对肝癌、胰腺癌等癌细胞具体调控作用，其高表达还可诱导肾小管上皮间充质转分化〔5，6〕；蛋白二硫化物异构酶(PDI)A3是调控人线粒体氧化应激的主要蛋白之一，前期生物信息学筛选发现PDIA3可能为miR-196a的直接靶基因。本研究旨在验证miR-196a与PDIA3的互补配对关系，探讨miR-196在肾小管间质纤维化过程中的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人肾小管上皮细胞(HKC) 购于上海匹拓生物科技有限公司；清洁级ICR小鼠，7～9周龄，体质量24～27 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。DMEM培养基、胎牛血清购于北京雅安达生物技术有限公司；转化生长因子(TGF)-β1购于江苏凯基生物技术股份有限公司；兔抗人α-血管平滑肌肌动蛋白(SMA)单克隆抗体、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗体购于上海信裕生物科技有限公司、LNA修饰的anti-miR-196a、pre-miR-196a购于广州赛诚生物科技有限公司。

1.2体外细胞学实验

1.2.1细胞培养与分组 将HKC细胞株接种到含10%胎牛血清的DMEM培养液中，CO2孵箱中常规培养。验证miR-196a是否参与调控肾小管上皮间充质转分化的实验分组：常规培养组、TGF-β1组(5 ng/ml TGF-β1处理HKC细胞)、anti-miR-196a+TGF-β1组(LNA修饰的anti-miR-196a寡核苷酸200 nmol/L转染HKC细胞24 h)。PDIA3为miR-196a对应靶基因验证实验分组：对照组(常规培养)、pre-NC组、anti-NC组、pre-miR-196a组、anti-miR-196a组、TGF-β1组、pre-NC+TGF-β1组、anti-NC+TGF-β1组、pre-miR-196a+TGF-β1组、 anti-miR-196a+TGF-β1组。

1.2.2Western印迹检测 离心收集各组细胞并提取总蛋白，定量后取50 μg行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，湿法转膜；室温孵育60min、洗膜、电化学发光(ECL)显影。一抗为兔抗人α- SMA 单克隆抗体(1∶200)、兔抗人PDIA3/ERp57多克隆抗体(1∶500)、鼠抗人β-actin(1∶1 000)；二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠抗体(1∶500)。

1.3体内动物实验

1.3.1小鼠单侧输尿管梗阻模型建立与分组 小鼠常规适应性喂养7 d，全麻后钝性游离左侧输尿管和肾脏，对左侧输尿管近肾盂端行结扎术；假手术组仅钝性游离左侧输尿管。随机分为：5 mg/kg及10 mg/kg干预组(输尿管结扎前30 min，经尾静脉注射剂量为5、10 mg/kg LNA修饰的anti-miR-196a寡核苷酸)，阴性对照组(注射剂量为10 mg/kg LNA修饰的anti-negative-miR-196a)，模型组、假手术组、空白对照组，每组各5只。

1.3.2肾脏组织学检查 肾组织经10%甲醛固定后用石蜡包埋，3 μm切片、常规苏木素-伊红(HE)染色。半定量标准进行肾小管间质损伤、肾小球硬化评分，高倍镜视野下选取20个无遮盖皮质视野，依据肾小管间质损伤面积评分：0分(正常)、1分(损伤面积<10%)、2分(10%～25%)、3分(26%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)。每张切片观察30个肾小球，依据硬化灶所占总面积比评分：0分(无病变)、1分(损伤面积<25%)、2分(25%～50%)、4分(51%～70%)、5分(>70%)，计算肾小球硬化指数。

1.3.3qRT-PCR检测miR-196a表达 提取小鼠肾组织标本总RNA，反转录得到cDNA，使用KAPA SYBR FAST 1-Step试剂盒进行检测，反应体系25 μl，反应条件：95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 15 s、72℃ 10 s，循环40次。miR-196a特异性扩增引物由广州赛诚生物科技有限公司设计完成。

1.3.4免疫组化检测 SP法分析各组小鼠肾小管上皮间充质转分化相关标志物〔α-SMA、波形蛋白(Vimentin)〕、PDIA3、硫氧还原蛋白(Trx)的表达水平。方法为：3 μm肾组织切片，微波修复抗原20 min，分别加入抗α-SMA(1∶100)、抗Vimentin(1∶100)、抗PDIA3(1∶200)、抗Trx(1∶150)，4℃孵育过夜，加二抗、室温孵育30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木素复染20 s，脱水、透明、中性树脂封片，用Image J软件进行半定量分析。

2 结 果

2.1miR-196a诱导肾小管上皮间充质转分化的细胞学研究 体外细胞实验显示，5 ng/ml的TGF-β1能够上调miR-196a表达并诱导肾小管上皮细胞发生上皮间充质转分化。TGF-β1组细胞中α-SMA表达量为1.75±0.32，明显高于常规培养组的1.12±0.10，差异有统计学意义(P<0.05)。anti-miR-196a+TGF-β1组α-SMA表达量为1.43±0.32，明显低于TGF-β1组(P<0.05)。

2.2PDIA3为miR-196a对应靶基因 pre-miR-196a组细胞中PDIA3蛋白表达量为0.35±0.06，明显低于pre-NC组的0.81±0.09(P<0.05)；anti-miR-196a+TGF-β1组PDIA3蛋白表达量为0.75±0.06，明显高于anti-NC+TGF-β1组的0.39±0.04(P<0.05)；表明PDIA3为miR-196a对应靶基因。见图1。

1为对照组；2a为pre-NC组，2b为anti-NC组；3a为pre-miR-196a组，3b为anti-miR-196a组；4为TGF-β1组；5a为pre-NC+TGF-β1组，5b为anti-NC+TGF-β1组；6a为pre-miR-196a+TGF-β1组，6b anti-miR-196a+TGF-β1组图1 各组PDIA3蛋白的Western印迹电泳图

2.3小鼠梗阻侧肾脏病理学改变 模型组和阴性对照组小鼠肾小管间质损伤、肾小球硬化评分均明显低于假手术组和空白对照组(P<0.01)；5、10 mg/kg干预组肾小管间质损伤评分明显低于模型组和阴性对照组(P<0.05)，其中以5 mg/kg干预组逆转肾小管间质纤维化作用更明显。见表1、图2。

2.4各组小鼠梗阻侧肾组织miR-196a表达情况 模型组小鼠梗阻侧肾组织miR-196a相对表达量为7.15±1.76，明显高于假手术组的0.67±0.29(P<0.01)；5、10 mg/kg干预组小鼠梗阻侧肾组织miR-196a相对表达量为3.14±0.61、4.36±3.72，明显低于模型组(P<0.05)。

2.5肾脏组织免疫组化检测 5、10 mg/kg干预组 α-SMA、Vimentin相对表达量明显低于模型组、阴性对照组(P<0.05)；5、10 mg/kg干预组 PDIA3蛋白表达明显高于模型组、阴性对照组(P<0.05)；5、10 mg/kg干预组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组小鼠肾组织损伤评分比较分，n=5)

与阴性对照组、模型组比较：1)P<0.05,2)P<0.01;下表同

图2 各组小鼠肾组织病理学改变(HE染色，×400)

表2 各组小鼠肾组织α-SMA、Vimentin、PDIA3相对表达量比较

2.6miR-196a抑制肾组织抗氧化应激反应 以Trx为抗氧化应激标志物，免疫组化检测显示，模型组小鼠肾组Trx表达量0.17±0.10，明显低于假手术组和空白对照组的0.75±0.16、0.69±0.13(P<0.05)；5、10 mg/kg干预组Trx表达量0.42±0.16、0.34±0.20，明显高于模型组和阴性对照组0.17±0.10、0.15±0.08(P<0.05)。

3 讨 论

miRNA可通过对靶mRNA的修饰来调控细胞多种生物学行为〔7〕。在miRNA调控肾小管上皮间充质转分化的研究中，证实了miR-196a表达随肾小管上皮细胞上皮间充质转分化的发生而明显上调，当抑制miR-196a表达后可部分逆转肾小管上皮间充质转分化现象。体内动物实验提示阻断miR-196a表达可部分逆转肾小管间质纤维化，但非剂量依赖性。

miRNA的生物学效应主要通过调控下游靶基因来实现〔8〕，前期生物信息学筛选发现参与细胞抗氧化应激的PDIA3是miR-196a预测靶基因之一；进一步行体外细胞学实验发现，转染pre-miR-196a可明显抑制HPTC细胞中PDIA3蛋白表达量，转染anti-miR-196a可有效逆转TGF-β1诱导的PDIA3表达下调。小鼠体内实验中行5 mg/kg anti-miR-196a干预后，梗阻侧肾组织中PDIA3蛋白表达上调，纤维化程度较模型组明显减轻，提示PDIA3为miR-196a对应靶基因，二者具有互补效应。PDIA3是调控人线粒体氧化应激的主要蛋白之一，本实验选取Trx为抗氧化反应指标，结果发现PDIA3表达下调的同时伴随着Trx表达下降，抑制miR-196a表达后，PDIA3表达上调的同时Trx也相应升高；提示出现肾小管间质纤维化时PDIA3表达下调并伴有肾组织抗氧化应激能力减弱，抑制细胞抗氧化应激是miR-196a参与肾脏损伤的重要机制之一。

4 参考文献

1石 晶,曹 喆,贾 琳.p66shc基因表达与老年糖尿病患者早期肾损伤的相关性〔J〕.中国老年学杂志,2017;37(3):603-5.

2许昌海,金红旭.持续性肾脏替代联合血必净对脓毒症患者炎症反应、免疫功能的影响〔J〕.中国卫生工程学,2016;15(5):499-500.

3周学萍,汪正光,张牧城,等.老年重症患者急性肾损伤的高危因素〔J〕.中国老年学杂志,2016;36(6):1435-8.

4Yang C,Jia Y,Zhao T,etal.Naked caspase 3 small interfering RNA is effective in cold preservation but not in autotransplantation of porcine kidneys〔J〕.J Surg Res,2013;181(2):342-54.

5许昌海,金红旭.持续性肾脏替代联合血必净对脓毒症患者炎症反应、免疫功能的影响〔J〕.中国卫生工程学,2016;15(5):499-500.

6陈小英,贾海红,李晓丽.NGAL和血清胱抑素C在预测妊高征肾脏损伤中的诊断价值〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2016;17(5):648-51.

7杨 伟.EGCG对顺铂诱导大鼠肾损伤的保护作用及相关机制研究〔D〕.锦州：锦州医科大学,2016.

8刘远辉.miRNA-20a靶向Atg7影响的自噬对造影剂诱导的急性肾损伤的机制研究及新的急性肾损伤危险因素探讨〔D〕.广州：南方医科大学,2016.