Aβ42介导的阿尔茨海默病对小脑AMPA受体GluR2亚基及caspase-3表达的影响

赵 明 闫 雷 龚守良 隋汝波

(锦州医科大学附属第一医院神经内科，辽宁 锦州 121001)

DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofJinzhouMedicalUniversity,Jinzhou121001,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo study the effect of neurotoxicity mediated byβ-amyloid protein 42(Aβ42) on expressions of cerebellar AMPA receptor (AMPAR) GluR2 subunit and caspase-3 protein and gene.MethodsAlzheimer′s disease (AD) animal model was prepared by intracerebroventricular injection of Aβ42 (5 μl), and water maze test was used to screen and enroll SD rats. Samples were randomly divided into control (intracerebroventricular injection of 5 μl saline) and Aβ42 intracerebroventricular injection group, and the expressions of GluR2 subunit, caspase-3 protein and gene of cerebellum AMPAR were detected by immunohistochemical staining, Western blot and RT-PCR.ResultsThe expressions of GluR2 subunit gene and protein in the Aβ42 intracerebroventricular injection group were significantly lower than those of control group (P<0.05). while the expression of caspase-3 was significantly higher than that of control group (P<0.05), and the results of Western blot were consistent with the results of RT-PCR.ConclusionsNeurotoxicity mediated by Aβ42 affects the expressions of GluR2 subunits and caspase-3 in cerebellar AMPAR, and AMPAR participates in the neurotoxicity mediated by Aβ42 in the cerebellum of rats with AD via caspase-3.

【Keywords】 Alzheimer′s disease; β-amyloid 42 (Aβ42); Cerebellum; AMPAR; Caspase-3

有研究显示，小脑作为神经系统的一部分，不仅在运动方面起作用，其在认知功能、自主神经系统及边缘系统中同样起重要作用〔1〕。学习记忆能力受多种因素调控，目前关于突触可塑性及神经递质的研究较多，长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)是两种主要类型的突触可塑性功能〔2〕。小脑浦肯野细胞层高表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体(AMPAR)〔3〕，而AMPAR诱导LTP/LTD的形成是学习记忆的重要模型〔4〕。AMPAR是由4种不同基因编码的亚基组成，即谷氨酸受体(GluR)1、2、3和4，其中GluR2亚基由于其mRNA Q/R位点编辑引起的低Ca2+通透性，使其在AMPAR中的相对含量决定了AMPAR的功能特性。β-淀粉样蛋白(Aβ)由39 ～ 43个氨基酸组成，其二聚体是最小的突触毒性物质，是引起阿尔茨海默病(AD)的重要物质。Aβ可被蛋白酶作用而分解为氨基酸的残基亚型，其中最常见的是Aβ40和Aβ42，后者与AD病情相关。本研究探讨Aβ42介导的AD对小脑AMPAR的GluR2亚基及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3表达的影响。

1 材料与方法

1.1动物与分组 实验动物是由中国北京维通利华实验动物技术有限公司提供的SPF级8周龄雄性SD大鼠24只，体重220～260 g，随机分为对照组和Aβ42组。许可证号：SCXK(京)NO11400700058126。

1.2造模方法 Aβ42组每隔1 d给予80 μmol/L Aβ42 5 μl侧脑室注射；对照组每隔1 d侧脑室注射5 μl生理盐水。17 d后进行水迷宫实验，取实验样品。

1.3主要试剂和仪器 鼠抗GluR2抗体(Sigma P-246)、鼠抗caspase-3抗体(NOVUS NB600-1372)和鼠抗肌动蛋白(actin)抗体(Abcam ab18570)等试剂；倒置显微镜(德国 Leica，4 000 b)；双 臂 小 动 物 脑 立 体 定 位 仪 ( 美 国 Stoelting，51903)；全自动荧光和化学发光成像分析系统(美国UVP，Bio Spectrum 510)。

1.4Morris水迷宫测试 在水迷宫的采集培训期间，要求大鼠连续5 d找到一个隐藏平台，第6～8天评估空间学习能力。同时测定大鼠到达平台的有效路径。

1.5脑组织取材 每组中任选3只大鼠于10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛缓冲液灌流固定48 h以上，小脑经30%蔗糖沉降48 h后，用冰冻切片机制备18 μm脑组织切片，置于含1%叠氮钠的磷酸盐缓冲液(PBS)中4℃保存。用于免疫荧光染色。 分别随机选择3只大鼠，麻醉后直接断头解剖，收集小脑组织于EP管中，置于-80℃保存，用于Western印迹检测和PCR检测。

1.6Western印迹 组织蛋白提取，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒蛋白定量，根据所需蛋白分子量大小配制适宜浓度十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分离胶和浓缩胶，起始加样孔加5倍重悬缓冲液(RSB)5 μl，按顺序向加样孔中逐个加入20 μl蛋白样品，剩余空泳道加入5 μl RSB，电泳，转膜，GluR2、caspase-3抗体孵育，增强电化学发光法(ECL)显像。

1.7免疫组化荧光显色 进行小脑冰冻切片(18 μm)，羊血清封闭1 h；Ⅰ 抗：鼠抗GluR2抗体(Sigma P-246)(1∶1 000)；Ⅱ抗：兔抗鼠免疫球蛋白(Ig)G，常规PBS冲洗5 min，共3次，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核10 min，甘油封片并镜检。

1.8RT-PCR 将装有组织的EP管至于冰上，向每个EP管中加入1 ml Trizol，混匀，用超声波破碎仪打碎后，冰浴条件静止10 min，各加入氯仿0.2 ml，摇匀，冰浴条件静止10 min，4℃离心15 min，12 000 r/min，取上清液至另一已标记好的EP管中，加入0.5 ml异丙醇，混匀，冰浴条件静止10 min，4℃离心10 min 12 000 r/min，弃上清液后75%乙醇1 ml洗涤，4℃离心机7 500 r/min离心5 min弃上清液。自然风干5 min。取适量DEPC水加入EP管，溶解RNA，测定RNA样品浓度。设计引物，反转录成cDNA，扩增，上样、电泳，显像及条带分析。

1.9统计学方法 用SPSS19.0软件行配对t检验。

2 结 果

2.1两组大鼠逃避潜伏期及有效路径情况比较 连续5 d的训练大鼠找到隐藏的平台的时间逐渐缩短，有效路径显著增高。第6～8天，Aβ42组大鼠穿过平台次数百分比〔(24.48±0.29)%〕较对照组〔(32.45±0.48)%〕明显降低(P<0.05)；Aβ42组穿过平台次数〔(2.45±0.23)次〕较对照组〔(4.32±0.56)次〕明显减少(P<0.05)。

2.2两组GluR2和caspase-3蛋白表达情况比较 Aβ42组GluR2亚基表达水平(0.76 ± 0.80)较对照组(1.03 ± 0.13)明显减少(P<0.01)。Aβ42组caspase-3表达水平(0.63 ± 0.08)较对照组(0.55 ± 0.78)明显增高(P<0.05)。见图1。

2.3两组GluR2亚基免疫荧光检测比较 Aβ42组GluR2(8.59±0.88)较对照组(15.53±0.87)表达明显减少(P<0.05)。见图2。

2.4两组GluR2、caspase-3基因表达比较 Aβ42组GluR2基因表达量(1.14 ± 0.18)较对照组(1.55 ± 0.07)显著减少(P<0.01)。Aβ42组caspase-3基因表达量(0.58 ± 0.11)较对照组(0.43 ± 0.09)显著增加(P<0.05)。见图3。

图1 两组GluR2和caspase-3蛋白表达

图2 两组GluR2免疫组化荧光显色

图3 两组GluR2和caspase-3基因表达

3 讨 论

既往小脑被认为AD不被累及的脑组织区域，且在影像学上被作为对照研究。近年来的研究及PET的应用进一步证实小脑并不能作为AD患者的脑组织参考区域〔5〕。也有研究发现，电刺激小脑顶核可改善Aβ42诱导的大鼠空间学习记忆障碍〔6〕。Hu等〔7〕研究发现，具有促进Aβ形成作用的mRNA亚型FE65，在AD患者小脑上表达上调。由此有理由推断小脑参与了AD病程。

AMPAR是由四聚体构成的离子通道受体，与NMDAR和KAR介导中枢神经系统兴奋性突触传递〔8〕。AMPAR介导中枢神经系统快速兴奋性突触传递，在突触后膜的动态表达与LTP和LTD的诱发和维持有关，参与调解学习记忆活动〔9〕。在小脑中，LTD的形成是由于GluR2亚基磷酸化作用导致受体内化，LTP 的形成是由于GluR2的脱磷酸化作用，使GluR2亚基表达于细胞膜表面〔10〕。此外，大部分AMPAR对Ca2+不通透，因为四聚体中含有GluR2亚基受体，然而缺乏GluR2亚基可致Ca2+通透，调节突触可塑性甚至介导神经毒性〔11〕。本实验中，Aβ42组GluR2亚基表达量下降可能与GluR2亚基磷酸化导致受体内化有关，而扰乱GluR2亚基的插入和胞吞可致突触可塑性机制受损及LTP/LTD等突触可塑性事件发生异常，这与AD早期认知功能障碍存在紧密联系。另一方面，含GluR2亚基的AMPAR减少，可导致Ca2+内流增加，导致钙超载。研究表明，AD属于一种多因素疾病，涉及多种病理机制，最终形成凋亡理论〔12〕。D′Amelio等〔13〕研究发现，caspase-3可早期导致AD小鼠突触功能丧失。本实验证实Aβ42组小脑中caspase-3蛋白及基因表达较对照组增高，其可能机制是GluR2亚基下调导致钙超载。然而，caspase-3是否进一步诱导AMPAR的GluR2亚基表达量下降有待于进一步研究证实。本实验研究结果主要是在组织水平获取的，后期实验可进一步行细胞研究及对GluR2亚基磷酸化水平进行检测，并对小脑进行形态学监测可更加明确这一观点。

综上，本结果表明，侧脑室注射Aβ可成功制造AD大鼠模型。AMPAR的GluR2亚基可通过改变AD大鼠小脑LTP/LTD形成导致小脑突触可塑性发生变化，从而对学习记忆产生影响。GluR2亚基下调的同时导致Ca2+内流，可产生神经毒性，进一步证实小脑参与了AD病程。

4 参考文献

1Schmahmann JD.Cerebellum in Alzheimer′s disease and frontotemporal dementia：not a silent bystander 〔J〕.Brain，2016；139(Pt 5)：1314-8.

2赵 欣，葛荣靖，赵士弟.GABA在学习记忆中相关作用的研究进展 〔J〕.包头医学院学报，2017；33(5)：136-7，140.

3Kotajima-Murakami H，Narumi S，Yuzaki M，etal.Involvement of GluR2 in fear-conditioned bradycardia in mice 〔J〕.PLoS One，2016；11(11)：e0166144.

4Keifer J，Zheng Z.AMPA receptor trafficking and learning 〔J〕.Eur J Neurosci，2010；32(2)：269-77.

5Lyoo CH，Ikawa M，Liow JS，etal.Cerebellum can serve as a pseudo-reference region in Alzheimer disease to detect neuroinflammation measured with PET radioligand binding to translocator protein〔J〕.J Nucl Med，2015；56(5)：701-6.

6王小林，王永红，罗 晶，等.电刺激小脑顶核对AD大鼠学习记忆能力及海马神经元凋亡的影响 〔J〕.重庆医科大学学报，2009；34(2)：157-60.

7Hu Q，Jin LW，Starbuck MY，etal.Broadly altered expression of the mRNA isoforms of FE65，a facilitator of beta amyloidogenesis，in Alzheimer cerebellum and other brain regions〔J〕.J Neurosci Res，2000；60(1)：73-86.

8Greger IH，Watson JF，Cull-Candy SG.Structural and functional architecture of AMPA-type glutamate receptors and their auxiliary proteins 〔J〕.Neuron，2017；94(4)：713-30.

9赵正宏，郭 军.AMPA受体与阿尔茨海默病 〔J〕.生命的化学，2010；30(2)：202-6.

10Din N，Ahmad I，Ul Hag I，etal.The function of GluR1 and GluR2 in cerebellar and hippocampal LTP and LTD is regulated by interplay of phosphorylation and O-GlcNAc modification 〔J〕.J Cell Biochem，2010；109(3)：585-97.

11Petralia RS，Sans N，Wang YX，etal.Loss of GLUR2 alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor subunit differentially affects remaining synaptic glutamate receptors in cerebellum and cochlear nuclei〔J〕.Eur J Neuroscience，2004；19(8)：2017-29.

12魏春杰，王增冕，李桂兰，等.阿尔茨海默病模型大鼠海马组织可塑性变化及其对谷氨酸受体与相关蛋白的影响 〔J〕.中国老年学杂志，2017；37(5)：1073-4.

13D′Amelio M，Cavallucci V，Middei S，etal.Caspase-3 triggers early synaptic dysfunction in a mouse model of Alzheimer′s disease 〔J〕.Nat Neuroscience，2011；14(1)：69-76.