瞬时受体电位通道5时间分辨荧光免疫分析法的建立和验证

陆扬帆， 黄 飚， 马 鑫

（1.江南大学药学院，江苏 无锡 214000；2.江苏省原子医学研究所，江苏 无锡 214063）

细胞膜瞬时受体电位通道5（transient receptor potential channel 5，TRPC5）是一类具有四聚体结构的非选择性阳离子通道，对Ca2+通透，参与细胞对渗透压反应的调控[1-2]。有研究结果表明，细胞膜微泡（extracellular vesicle，EV）是耐药乳腺肿瘤细胞受到药物刺激后特异性从乳腺肿瘤细胞表面通过细胞膜出芽方式大量生成的直径为100～500 nm的膜泡，该EV包裹化疗药物并携带TRPC5等关键蛋白进入血循环[3-5]，TRPC5或许可作为乳腺癌耐药诊断的标志物。本研究采用时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）建立了TRPC5 TRFIA。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

MUC1 抗体（ab70475）购自美国Abcam公司，Sulfo-SMCC、KLH、Sulfolink Resin 购自美国Pierce公司，福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购自美国Sigma公司，TRPC5多肽标准品由上海强耀生物科技有限公司合成。透析袋购自美国Viskase公司，PD-10柱购自美国BioRad公司，免疫磁珠购自苏州Beaver公司，Auto DELFIA 1235全自动TRFIA检测仪为美国PE - Wallac公司产品。

1.2 试剂的配制

1.2.1 TRPC5标准品溶液配制 将TRPC5标准品稀释成0 、5 、10 、20 、40 、50 、80 、100 、200、400、500 、800 和1 000 ng/mL系列浓度，稀释液为0.1 mol/L pH值7.5的磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）。

1.2.2 β2缓冲液 分别称量9 g NaCl、5 g牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、20 μmol 二乙烯三胺五乙酸和0.5 g NaN3，定容至1 L，调节pH值为7.8。

1.2.3 洗脱缓冲液 分别称量9 g NaCl、3 g BSA、1 g NaN3，定容至1 L，调节pH值为7.8。

1.2.4 包被缓冲液 分别称量1.59 gNa2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，调节pH值为9.6。

1.2.5 平衡缓冲液 分别称量0.9 g NaCl、1.59 g Na2CO3、2.96 g NaHCO3，定容至1 L，调节pH值为8.5。

1.3 方法

1.3.1 抗TRPC5多克隆抗体的制备 由上海强耀生物科技有限公司制备。抗TRPC5多克隆抗体TRPC5多肽是一种半抗原，没有免疫原性，故采用TRPC5与血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）耦联作为免疫抗原免疫新西兰大白兔。具体方法为：第1天，取抗原1 mL加入1 mL福氏完全佐剂，乳化，于大白兔颈背部皮下多点注射；第14、28、42天，每次取抗原1 mL加入1 mL福氏不完全佐剂，乳化，于大白兔颈背部皮下多点注射；第52天，于颈动脉取血，将大白兔处死，兔血在4 ℃放置过夜，4 ℃ 10 000×g离心30 min，收集上清；亲和纯化血清后，将其分装备用。

1.3.2 黏蛋白（mucin1，MUC1）包被磁珠的制备 参考免疫磁珠试剂盒方法包被磁珠，具体步骤为：取50 μg MUC1用平衡缓冲液配成浓度 ≥3.0 mg/mL 的蛋白溶液，取500 μL磁珠悬浮液于1.5 mL聚丙烯离心管中，将聚丙烯离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液，加1 mL 2～8 ℃的洗涤液A于离心管中，涡旋15 s，使磁珠混合均匀。将Eppendorf管置于磁性分离架内，富集磁珠，去除上清液。加200 μL蛋白溶液于聚丙烯离心管中，涡旋30 s，使其混合均匀。将聚丙烯离心管涡旋15 s，置于垂直混合仪上，4 ℃反应过夜。采用磁性分离架富集磁珠，加1 mL 封闭液于Eppendorf管中，涡旋30 s，将Eppendorf管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。加1 mL 封闭液于聚丙烯离心管中，涡旋30 s，将聚丙烯离心管置于垂直混合仪中室温反应2 h。将聚丙烯离心管置于磁性分离架内，富集磁珠，弃上清液。加1 mL 超纯水于聚丙烯离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。加1 mL 储存液于聚丙烯离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次，加入1 mL 储存液于聚丙烯离心管中，充分混合，4 ℃保存备用。

1.3.3 包被板固相抗原的制备 将TRPC5多肽用包被缓冲液稀释成0.19 μg/L的包被液，在96孔包被板中各孔加100 μL，震荡混匀，4 ℃放置过夜。弃去包被液，拍干残留液体后，每孔加入200 μL含3 g/L BSA的上述缓冲液封闭，室温放置2 h。弃去封闭液，拍干残留液体后，于烘箱中干燥，置-20 ℃保存。

1.3.4 Eu3+-羊抗兔抗体的制备 取溶解于50 mmol/L PBS pH值7.0缓冲液的羊抗兔抗体5～10 mg，经截留相对分子质量为50 000的超滤管转换缓冲体系，将缓冲体系换为平衡缓冲液。取500～1 000 μL转换缓冲体系后的羊抗兔抗体于1.5 mL 离心管中，加入0.2～0.4 mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，25 ℃震荡混合，反应过夜。反应液经用80 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷-HCl pH值7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1 cm×40 cm）层析，稀释分装备用。

1.3.5 检测步骤 （1）样本预处理：为了尽可能排除血清中其他因素对检测结果的影响，先进行样本预处理。用促凝血清管采集新鲜血液，1 000×g离心5 min后收集上清；用包被有MUC1抗体的免疫磁珠与收集到的上清于25 ℃震荡孵育1 h；用磁力架吸附磁珠，弃去上清液，用PBS柔和清洗磁珠；用磁力架吸附磁珠，弃去上清液，再用PBS重悬作为待测样本。（2）TRPC5 TRFIA检测步骤：取包被有包被原（TRPC5多肽）的96孔包被板，加50 μL TRPC5标准品或已经用MUC1磁珠预处理过的待测样本到各自的微孔中，加50 μL用洗脱缓冲液稀释的抗TRPC5抗体，于25 ℃振荡孵育1 h，洗涤4次，加入用β2缓冲液稀释的100 μL Eu3+-羊抗兔抗体，于25 ℃振荡孵育1 h，洗涤6次，加入200 μL增强液振荡5 min后测量荧光强度，根据标准曲线计算样本中的TRPC5含量。

1.3.6 离心法收集血清样本中的EV 收集血清样本，按梯度进行离心： 以4 000×g 4 ℃离心10 min，取上清；以12 000×g 4 ℃离心30 min，取上清；以100 000×g 4 ℃离心2 h，弃去上清，PBS重悬沉淀，收集EV。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，数据分析采用配对t检验及两变量的相关和回归分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗TRPC5抗体稀释

在TRPC5多肽板条中加分析缓冲液稀释的不同浓度的抗TRPC5抗体，抑制率为最高浓度（1∶50稀释）兔血清结合率的30%～50%时对应的稀释度为1∶1 000～1∶2 000，因此合适的工作浓度应在此范围内，选择1∶1 000稀释。见图1。

2.2 TRPC5多肽固相抗原包被量的优化

用包被液将TRPC5多肽稀释为不同浓度进行包被，采用TRPC5 TRFIA检测，作各浓度点荧光强度的双对数函数曲线，见图2。当TRPC5固相抗原包被量为0.19 μg/mL时，其曲线的斜率较大，不同浓度TRPC5多肽区分度较高，因此固相抗原选用浓度为0.19 μg/mL TRPC5的多肽进行包被。

图1 TRPC5 TRFIA抗体稀释度曲线

图2 不同浓度TRPC5多肽包被的TRPC5 TRFIA标准曲线

2.3 TRPC5 TRFIA的考核

TRPC5 TRFIA的结果经对数函数处理所得的标准曲线见图3。

图3 TRPC5 TRFIA标准曲线

2.3.1 方法的敏感性和稳定性 以零剂量点荧光强度x -2s后的荧光强度在标准曲线上得到的相应值为检测的敏感性，TRPC5 TRFIA的敏感性为1 ng/mL。精确度测量范围变异系数（coefficient of variation，CV）＜10 %，即TRPC5浓度为5～500 ng/mL，见图4。运用TRPC5 TRFIA检测，3个效应点检测值ED80、ED50、ED20分别为（4.68±0.13）、（321.66±2.77）和（714.42±4.07）ng/mL。说明剂量反应曲线的位置漂移较小，方法的稳定性较好。

图4 TRPC5 TRFIA精确度曲线

2.3.2 方法的精密度和回收率 随机抽取的96孔微孔板反应条经Eu3+-羊抗兔抗体示踪的结果见表1。经统计学分析，各孔计数值CV为5.5%，其中4条反应板的CV均＜10.0%，说明此种96孔微孔板各孔的均一性及重复性良好，完全能够满足TRFIA的要求。见表1。

以健康女性样本为空白血清基质，在其中添加不同量的TRPC5标准品，使其最终浓度为 0～1 000 ng/mL，应用TRPC5 TRFIA检测各个样本TRPC5的浓度，计算回收率，见表2。5个空白添加样本的平均回收率为94.61%，不同加样量的平均空白加样回收率均在85.00%～115.00%之间，能满足免疫分析的要求，表明该方法具有较好的准确性。

表1 96孔板均一性测定

表2 间接TRFIA测定样本中TRPC5的回收率

2.3.3 TRPC5 TRFIA的临床应用 收集临床血清样本，乳腺癌化疗耐药患者21例，化疗耐受尚可患者21例，正常对照者12名，使用TRPC5 TRFIA检测乳腺癌来源TRPC5含量，结果见图5。正常对照组与化疗耐受尚可组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而化疗耐药组与化疗耐受尚可组比较，差异有统计学意义（p＜0.000 1）。

2.3.4 MUC1磁珠富集EV与离心收集EV效果的比较 将上述收集到的血清样本，用超高速离心方法分离收集其中的EV，取与磁珠富集方法收集EV过程中等量的血清所收集到的EV，直接使用TRPC5 TRFIA检测其中TRPC5的含量，并与磁珠富集方法收集EV的结果进行相关性分析，2种方法检测的结果呈正相关（r2=0.695 8，p＜0.000 1）。见图6。

图5 TRPC5 TRFIA临床检测结果

图6 磁珠富集EV与离心收集EV的相关性

3 讨论

乳腺癌是女性常见的肿瘤，严重威胁女性的身心健康。化学药物治疗是乳腺癌的主要治疗手段之一，但90%以上肿瘤患者死于不同程度的化疗耐药。对化疗药物产生耐药已经成为肿瘤治疗的一大难题。目前，早期诊断肿瘤的最新、最有效的方法是检测血中的肿瘤标志物。肿瘤标志物是指在肿瘤发生、发展的过程中，能反应细胞癌变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标志物的检测，可以对相应肿瘤进行早期诊断、疗效观察和肿瘤复发状况监测[6-7]。因此，在深入研究耐药机制的基础上，开发肿瘤耐药分子的诊断指标、方法，实现试剂化，从而做到耐药早期动态监测，在现阶段对于乳腺癌耐药的诊疗至关重要，也为优化药物结构设计、研发耐药逆转药物提供有益借鉴，因而具有重大而现实的社会价值。

MUC1在正常细胞表达时是一种跨膜糖蛋白，正常情况下，在乳腺、胃肠道及泌尿生殖道的上皮细胞顶端表达，糖基化完全。MUC1对正常上皮起润滑和保护、介导信号转导和细胞黏附作用。在乳腺癌细胞株MCF-7中通过磷酸化，MUC1能结合Rrb/SOS，参与受体酪氨酸激酶介导的信号转导，而酪氨酸磷酸化是膜受体参与信号转导的一个关键步骤[8]。乳腺癌MUC1的表达特点为：高表达、异常表达低；糖基化、高唾液酸化；顶端定位不清，极性混乱；细胞浆和细胞表面都有过度表达，并且这些分子会从乳腺癌细胞进入血清。基底样乳腺癌患者高表达 MUC1，约有92% 的患者能检测出过表达的MUC1。

免疫磁珠，也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上由载体微球和免疫配基结合而成。免疫磁珠技术，是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术，以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原-抗体复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，从而达到分离抗原的目的[9-10]。

TRFIA是超微量检测领域中一项新兴的检测技术，在医学检验方面已得到长足发展，其是利用免疫反应的高度特异性与标记示踪物的高度敏感性相结合而建立的一类微量物质检测技术。全自动TRFIA检测限为10～18 mol/L，大大优于酶联免疫吸附试验的10-10mol/L和放射免疫法的10-12mol/L，所以世界卫生组织推荐将此技术作为医学领域中的超微量检测技术[11]。采用TRFIA进行TRPC5检测的敏感性可达1 ng/mL，检测范围可达5～500 ng/mL，根据临床样本检测分析，发现其对于乳腺癌化疗耐药及化疗耐受尚可患者有一定的区分能力，值得加大临床样本量进行进一步分析。

[1]MARINA M， SAAVEDRA H I. Nek2 and Plk4：prognostic markers， drivers of breast tumorigenesis and drug resistance[J]. Front Biosci （Landmark Ed）， 2014， 19：352-365.

[2]MONTELL C. The TRP superfamily of cation channels.[J]. Sci STKE， 2005， 2005（272）：re3.

[3]MA X， CAI Y， HE D， et al. Transient receptor potential channel TRPC5 is essential for P-glycoprotein induction in drug-resistant cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（40）：16282-16287.

[4]MA X， CHEN Z， HUA D， et al. Essential role for TrpC5-containing extracellular vesicles in breast cancer with chemotherapeutic resistance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2014， 111（17）：6389-6394.

[5]马鑫， 金坚， 汪淋军，等. EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用： CN 103954770 A[P].2014-07-30.

[6]HANASH S M， PITTERI S J， FACA V M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers[J].Nature， 2008， 452（7187）：571-579.

[7]杨文蔚， 王志恒， 岳朝艳. 乳腺癌患者血清CA153、CEA、铁蛋白和降钙素水平的变化及临床意义[J]. 检验医学，2017，32（4）：308-310.

[8]周龙， 雷建平， 李瑶. 粘蛋白（MUC1）与肿瘤的关系[J]. 江西医药， 2008，43（4）：364-367.

[9]张璇， 鲜瑶. 免疫磁珠技术及其在食品微生物检测中的应用[J]. 农产品质量与安全， 2011，1：40-43.

[10]盛跃颖，陈洪友，张曦，等. 免疫磁珠捕获法检测志贺菌的模拟研究[J]. 检验医学， 2012， 27（3）：167-170.

[11]朱岚，黄飚，张珏，等. 甲状腺球蛋白抗体竞争TRFIA技术的建立及临床应用[J]. 检验医学，2013， 28（4）：305-307.