参麦注射液对急性束缚性应激大鼠大脑皮质Bcl-2/Bax表达及炎症因子的影响*

郏丹赟 王均炉 莫云长 耿武军 戴勤学

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325000）

参麦注射液具有益气固脱、养阴生津、生脉等功效，目前已广泛用于治疗心血管、呼吸、神经系统疾病［1-2]。参麦注射液作为一种急诊用药，大量研究表明其对神经元损伤和大脑皮质具有保护作用［2-3]。急性应激是机体在各种危重情况下导致的全身性非特异性适应性反应，会导致大脑皮质炎症因子分泌的增加［4]。研究表明，急性应激会使大脑功能减退，造成神经元损害［5]。基因调控的自主性、程序性细胞死亡过程控制着神经细胞凋亡过程，Bcl-2基因对细胞凋亡发挥抑制作用，Bax基因则对细胞凋亡发挥促进作用，二者是一对比较成熟的基因［6]。本实验通过建立急性束缚性应激大鼠模型，观察参麦注射液预处理后大鼠大脑皮质Bcl-2/Bax和炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）的表达，探讨参麦注射液在急性应激方面的作用及其可能机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性 SD 大鼠 24只，体质量（250±10）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2007-0005。

1.2 试药及仪器

参麦注射液（正大青春宝药业有限公司，批号：）。束缚器 （ZH-TXQ，杭州雷琪实验器材有限公司，中国）；大鼠皮质酮（CORT）和促肾上腺皮质激（ACTH）ELISA试剂盒和大鼠炎症因子（TNF-α和IL-6）ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；TRIzol试剂盒（15596，Invitrogen，USA），反转录试剂盒（BS-PCR005，Bio-Serve），PCR 扩 增 采 试 剂 盒 （BS-PCR003，Bio-Serve）；10%水合氯醛；酶标仪 （DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo，芬兰）；0.9%氯化钠注射液；定量PCR仪器 （ABI7500，ABI，USA）； 微量分光光度计（NanoDrop1000，Thermo，USA）。 BCA 蛋白质定量试剂盒（p0012，碧云天）。

1.3 分组与造模

SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、参麦对照组、模型组、参麦预处理组，每组6只。模型组和参麦预处理组大鼠均行急性束缚应激模型制备［7]：采用ZH-TXQ型专业大白鼠固定器，抓住大鼠尾端，其本能的钻入束缚器，然后调节束缚器的长度使大鼠制动2 h。参麦预处理组于制模前30 min腹腔注射参麦注射液15mL/kg，模型组与相同时间点腹腔注射0.9%氯化钠注射液15mL/kg。正常对照组和参麦对照组不制模，仅于相应时间点分别注射等量0.9%氯化钠注射液或参麦注射液［3，8]。本实验中动物模型建立和处理方法符合动物伦理学标准。

1.4 标本采集与检测

1.4.1 激素测定 于制模前和制模后腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠，取內眦静脉血1mL，收集在冷冻过的肝素化小离心管（EP管）中，4℃下离心15min，取血浆于-20℃保存待测。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）水平。

1.4.2 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定Bcl-2、BaxmRNA表达 于制模后30min麻醉大鼠，活杀取大脑，冰上游离皮质组织，快速置于-80℃液氮中保存。用TRIzol法提取皮质RNA和甲醛变性，凝胶电泳测试完整性，在波长260 nm和280 nm处测定RNA吸光度（A）值，计算RNA的纯度和浓度。反转录成cDNA，引物由GeneBank使用基因探索者软件自行设计，引物序列见表1。反应条件：95℃、3min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35～40 个循环；最后72℃、15 min。以目的基因与内参基因3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的A值比值表示目的基因表达量。

表1 引物序列

1.4.3 蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）测定Bcl-2、Bax蛋白表达 取大鼠大脑皮质组织，提取蛋白质，用BCA法定量蛋白质，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜、封闭，抗体孵育，将膜置于反应液中，室温孵育，X线曝光胶片。扫描图片，用AlphaEaseFC 4.0软件分析特异条带的灰度值并数字化，以Bcl-2或Bax蛋白与内参GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白表达量。

1.4.4 炎症因子测定 于制模后30 min麻醉大鼠，活杀取大脑，冰上游离皮质组织，按按照ELISA试剂盒说明书上操作方法检测大脑皮质炎症因子TNF-α、IL-6水平。

1.5 统计学处理

应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，制模前后两组数据比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 模型组大鼠造模前后激素水平比较

见表2。大鼠急性束缚应激后血浆ACTH和CORT水平均明显高于应激前（均P＜0.01）。

表2 模型组大鼠急性束缚性应激前后血浆ACTH和CORT 水平比较（分，±s）

表2 模型组大鼠急性束缚性应激前后血浆ACTH和CORT 水平比较（分，±s）

与造模前比较，*P＜0.01。

时 间 n ACTH（pmol/L） CORT（nmol/L）造模前 6 547.397±13.538 2.921±0.490造模后 6 957.697±52.776* 8.982±0.970*

2.2 各组大鼠大脑皮质Bcl-2、Bax mRNA表达水平比较

见表3。与正常对照组和参麦对照组比较，模型组Bcl-2 mRNA表达明显降低，BaxmRNA表达明显增高（均P＜0.01）。与模型组比较，参麦预处理组Bcl-2 mRNA表达明显增高，Bax mRNA表达明显降低 （均P＜0.01）。参麦对照组与正常对照组Bcl-2、BaxmRNA表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠大脑皮质Bcl-2、BaxmRNA表达水平及蛋白表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠大脑皮质Bcl-2、BaxmRNA表达水平及蛋白表达水平比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.01；与正常对照组和参麦对照组比较，△P＜0.01。下同。

组 别 mRNA表达（A值）蛋白表达（灰度值）正常对照组 Bcl-2 2.48±0.14 0.83±0.04（n＝6） Bax 0.83±0.07 0.89±0.02参麦对照组 Bcl-2 2.79±0.13 0.83±0.03（n＝6） Bax 0.81±0.03 0.85±0.02模型组 Bcl-2 1.76±0.07△ 0.81±0.03（n＝6） Bax 2.72±0.13 1.05±0.04△参麦预处理组 Bcl-2 2.68±0.06* 0.82±0.03（n＝6） Bax 0.82±0.08* 0.85±0.02*

2.3 各组大鼠大脑皮质Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较

见表3，图1。模型组Bax蛋白表达较正常对照组和参麦对照组明显增高（均P＜0.01）；而参麦预处理组Bax蛋白表达较模型组明显降低 （P＜0.01）。各组间Bcl-2蛋白表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图1 蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测各组大鼠大脑皮质组织Bcl-2、Bax蛋白表达

2.4 各组大鼠大脑皮质炎症因子TNF-α、IL-6表达水平比较

见表4。模型组炎性因子TNF-α、IL-6表达较正常对照组和参麦对照组明显增高（均P＜0.01）；而参麦预处理组炎性因子TNF-α、IL-6表达较模型组明显降低（均P＜0.01），与正常组和参麦对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 各组大鼠大脑皮质炎症因子TNF-α、IF-6表达水平比较（pg/mL，±s）

表4 各组大鼠大脑皮质炎症因子TNF-α、IF-6表达水平比较（pg/mL，±s）

组 别 n TNF-α IF-6正常对照组 6 38.50±0.52* 50.31±1.75*参麦对照组 6 38.48±0.66* 49.62±2.17*模型组 6 84.41±7.44 145.62±7.03参麦预处理组 6 44.66±2.04* 53.68±2.44*

3 讨 论

急性应激是现代生活中的社会常态。应激时糖皮质激素会增加（人体为皮质醇，大鼠为CORT），而激素长期增加会产生一系列生理病理变化［9-10]。应激时，应激性代谢反应会激活下丘脑-垂体轴，这个反应过程会使ACTH和CORT的量上升，从而触发后续炎症、免疫及行为改变［10]。本研究显示，制模后血浆ACTH和CORT水平明显高于制模前，表明急性束缚性应激动物模型制备成功。

应激是多种神经系统疾病的危险因素，其可以通过改变大脑的神经营养因子，导致神经损伤。本研究小组早期用急性束缚性应激，发现大鼠海马组织里的脑源性神经营养因子（BDNF）的表达明显下降［7]。在神经损伤过程中，Bcl-2和Bax家族在调控细胞凋亡中占据重要地位，Bcl-2蛋白是存在于细胞线粒体、核膜等处的一种膜合蛋白，可中断减弱凋亡信号的传递，具有抑制细胞凋亡和延长细胞寿命的作用；Bcl-2的同源蛋白Bax蛋白可以加速细胞凋亡，并且抑制Bcl-2的效应［11-12]。Bcl-2和Bax蛋白微量存在于正常细胞中，处于一种平衡状态，当细胞受到损害时，这种平衡相应改变，发动一系列损害效应［6]。本实验显示，给予急性束缚性应激时，大脑皮质组织中Bcl-2mRNA表达明显降低，而Bax的mRNA和蛋白表达明显增高，Bcl-2蛋白表达有一定降低，但差异无统计学意义，也间接地佐证了急性应激对Bcl-2/bax的调节作用，表明在急性应激情况下细胞Bcl-2/Bax平衡发生改变，启动脑损伤作用。但本实验为短期急性实验，因此缺少神经细胞形态、损伤和凋亡的观察，仍有待进一步深入研究。

应激同时会触发炎症反应，大量文献表明应激会使大脑皮质中的炎症因子表达发生改变。其中有研究表明炎症因子TNF-α和IL-6的增加使应激所致的病理生理改变的重要因素。本实验同时研究的大鼠皮质的炎症因子TNF-α和IL-6的改变，实验发现急性应激会使这两种炎性因子表达上升，这也佐证了炎症因子在应激反应中的重要性［4]。

参麦注射液有效成分为麦冬皂苷、人参皂苷、麦冬黄酮、麦冬多糖和人参多糖等。人参大补元气，麦冬养阴，五脏六腑皆赖其充养［13]。现代快步伐的生活状态，导致心悸气短，神疲头晕，失眠多梦等气阴两虚的状态，而参麦就有益气养阴的作用［14]。参附注射液是以温阳救逆为主，以及丹红注重于活血化瘀，均与本病不符，故而采用参麦注射液［14]。实验研究同时显示，参麦注射液可发挥多种多样的生物学功能，特别是在神经保护方面，能有效减轻脑水肿、调节兴奋性氨基酸递质的释放、抑制细胞凋亡、清除自由基［13，15]。 有实验研究发现给予腹腔注射参麦注射液15 mg/kg可以起到积极有效的脑保护作用［3，8]。本实验给予参麦注射液15 mg/kg预处理后再行急性束缚性应激，发现大鼠大脑皮质组织Bcl-2/Bax和炎症因子TNF-α和IL-6的表达基本保持平衡，与正常对照组大鼠相一致；而未予以急性束缚性应激的大鼠，在单纯给予参麦注射液后大脑皮质Bcl-2/Bax和炎症因子TNF-α和IL-6表达也基本与正常对照组保持一致，这就排除了参麦注射液本身对Bcl-2/Bax和炎症因子TNF-α和IL-6表达影响的干扰，同时表明正常机体状态下给予参麦注射液对Bcl-2/Bax和炎症因子TNF-α和IL-6无影响。

参考大量关于急性束缚性应激的实验研究，目前没有明确有效的药物对这类急性应激有效。因此本实验没有设立阳性药物对照组，这使实验存在略微不足，但对最终的结果影响不大。后续研究会进一步多角度地研究参麦注射液在急性应激的作用。

综上所述，急性束缚性应激可使大鼠大脑皮质Bcl-2mRNA表达明显下降，BaxmRNA和蛋白表达明显增高，炎症因子TNF-α和IL-6表达的增加，从而产生脑损害作用。参麦注射液预处理可通过维持大脑皮质Bcl-2/Bax和炎症因子TNF-α和IL-6的平衡来实现对急性束缚性应激大鼠的脑保护效应，这为临床上预防性使用参麦注射液提供了理论基础和科学依据。

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