白兰氏虫草鸡精对大鼠外周生物钟的调控作用研究

郑小君,王 琦,陆 鑫,傅正伟,倪银华

(浙江工业大学生物工程学院,中国浙江杭州310014)

随着现代生活节奏的加快,熬夜、饮食不规律等陋习逐渐成为常态,而这些陋习将导致一系列不良后果,如引起生理功能紊乱及各种代谢相关疾病等。研究显示,这些病症与生物钟紊乱存在着密不可分的联系[1]。生物钟受到日出日落、运动休息、饮食习惯、社交活动等因素影响,这些能够外源调节生物钟的因素称之为授时因子(Zeitgebertime,ZT)[2]。近年来,通过饮食习惯尤其是食物信号对生物钟进行调控成为人们的研究热点。国内外已有多项研究发现食物信号刺激不仅仅能够显著地影响子钟的节律,而且能在一定程度上诱导子钟脱离母钟的控制,甚至可能直接影响母钟的节律[3,4]。

白兰氏虫草鸡精(Brand’s Essence of Chicken with Cordyceps,BECC)富含蛋白质、多肽、人体所需的必需氨基酸和多种矿物质。经过成分分析,BECC含有L-肌肽(L-carnosine)、鹅肌肽(anserine)和牛磺酸等营养元素,长久以来被人们用作补充营养、增强体质的补益食品[5]。此外,BECC中还含有中国民间惯用的一种名贵滋补药材——冬虫夏草,它可入药,也可食用,是上乘的佳肴,具有很高的营养价值[6]。冬虫夏草含有不饱和脂肪酸、虫草酸、糖类脂肪、维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇和生物碱等多种营养成分,对人体有多种保健功能[7,8]。

为了研究BECC对哺乳动物生物钟系统的影响,我们通过构建短期颠倒光周期(打乱其生物节律),同时外源补充BECC的大鼠模型,从生理水平和基因转录水平,探究BECC对大鼠外周生物钟的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

250 g左右的雄性Wistar大鼠,由中国科学院上海实验动物研究中心提供。实验动物饲养在严格控制的人工模拟昼夜循环的环境中,光暗周期为12 h∶12 h,光源为日光灯,强度为200 lx,温度控制在22±1℃,自由饮水。在正常光周期下,将自然时间转换为授时因子,光照起点时间定为ZT0,光照结束时间定为ZT12,其余点按照对应的ZT时间点转换。实验大鼠在正常光周期条件下饲养1周适应环境,自由饮水但限制在暗期的12 h内摄食。实验大鼠在正式实验之前均为适应期,自由饮食饮水,基础饲料饲喂。基础饲料由中国科学院上海实验动物研究中心提供。

1.2 实验饲料及摄入量

BECC由新加坡(太平洋)食益补有限公司提供,每瓶68 mL,经冻干后为黄色粉末,约每瓶6 g,按照7.5%(质量比)的比例混合至基础饲料。在暗点给予饲料时,Control组给予足量的基础饲料,而BECC组给予含BECC的1 g饲料以及足量的基础饲料,BECC的摄入量为每只大鼠每天0.075 g。确保饲料在2 h内耗尽后,继续添加基础饲料供应小鼠夜间进食所需。

1.3 实验设计

实验设计如图1所示。大鼠随机均分成3组:1)Control组(30只)。正常光照周期,暗期喂食基础饲料;2)Normal组(60只)。正常光周期,暗期喂食基础饲料;3)BECC组(60只)。正常光周期,暗期喂食1 g含BECC的饲料以及足量的基础饲料。连续饲养2周后,Control组大鼠在正常光周期条件下,自ZT0起,每个时间点解剖5只大鼠,共计6个时间点,时间间隔为4 h。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后,颈动脉取血并取得肝脏和心脏等外周组织,迅速冷冻于液氮中,转而保存至-80℃冰箱中备用。Normal组和BECC组通过延长光照时间颠倒光周期,在颠倒光周期后的第3 d及第5 d,自ZT0起,每隔4 h,共计6个时间点,每个时间点解剖5只大鼠,保存血清及肝脏和心脏等外周组织。大鼠饲养全程监测其行为活动。

图1 实验设计图Fig.1 Experimental design chart

1.4 RNA的提取与浓度测定

用TRIZOL Reagent(Takara公司,Japan)提取心脏以及肝脏中总RNA(按说明书步骤操作)。用超微量紫外可见分光光度计(Ultrospec 4300 pro,Sweden)测定在260 nm与280 nm波长下的光密度值,得到RNA浓度。

1.5 反转录和实时定量PCR分析

RNA样本解冻混匀后,65℃预变性5 min,然后参照反转录试剂盒(Toyobo公司,Japan)说明书操作。反转录反应体系组成:2 μL ExScript buffer(5×);0.5 μL dNTP mixture;0.5 μL random primer;500 ng预变性后的total RNA;用RNase-Free ddH2O补足到10 μL。反应程序:体系混匀后,37℃水浴反应15 min,98℃水浴5 min,使反转录酶失活。反应完成后,用超纯水稀释4倍备用,即获得cD NA。定量PCR反应10 μL体系基本组成:1 μL模板 cDNA;5 μL SYBR Premix Ex Taq(2×);0.4 μL前引物;0.4 μL后引物 (引物序列详见表1);用超纯水补足到10 μL。使用RT-PCR仪(Mastercycler eppendorf realplex,USA)进行PCR反应,反应程序:95℃预变性1 min,95℃退火15 s,60℃延伸1 min,共40个循环。所有操作均在冰上进行。

1.6 行为活动分析

对9只大鼠(每组3只)每日行为活动进行监测分析。每只大鼠单独饲养在一个笼子内,笼子的正上方安装红外探头,每5 min采集一次数据。将红外探头采集接收的数据传输至电脑上,连续监测3周,实验结束后利用CompACTAMS软件(Activity Monitoring System,Muromachi公司,Japan)分析。

1.7 数据统计分析

使用2-ΔΔCt法比较阈值循环数(Ct),分析基因的相对表达量[9](以GAPDH作为管家基因进行校正),使用归一法分析基因表达的变化趋势。所有数据均用平均值±标准误差(x±sx)表示,使用Statview 5.0 software(SAS Institute Inc.,Cary NC,USA)进行方差分析,统计中的差异使用单因素方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)进行分析。*P＜0.05,有显著差异;**P＜0.01,差异极显著;P＞0.05则无显著性差异。

2 结果

2.1 BECC对大鼠在倒时差条件下肝脏生物钟基因的影响

肝脏是人体重要器官,受生物钟系统调节,日夜颠倒的环境将导致肝脏受损。我们检测了肝脏中生物钟关键基因Bmal1、Cry1在颠倒光周期后第3 d、第5 d的节律表达,结果见图2,统计学分析结果见表2。为比较不同组间基因表达的差异,将基因表达水平的峰值移动时间作为参照,分析BECC对适应时差反应的调节作用。如图2所示,第3 d时,与Control组相比,BECC组与Normal组中Bmal1与Cry1基因的峰值移动情况有明显差异,其中,Bmal1基因表达水平峰值在BECC组中移动了12 h,完成时相重置,在Normal组中只移动了4 h;而Cry1基因的表达水平峰值在Normal组中移动了8 h,在BECC组中移动了12 h。第5 d时,BECC组与Normal组中Bmal1基因和Cry1基因表达水平峰值均移动了12 h,均完成时相重置。如表2所示,BECC组中Bmal1和Cry1基因表达峰值与Control组相比发生了明显的移动,且均呈现节律性表达。

图2 BECC在倒时差条件下对肝脏生物钟基因重置的影响Fig.2 The effects of BECC administration on the reset原ting processes of clock genes in the liver of rats after the experimental jet lag

表1 引物序列Table1 Primer sequences used for PCR amplification

表2 BECC对大鼠肝脏中生物钟基因表达的影响Table2 Effect of BECC administration on rhythmic expression of the clock genes in rat liver

2.2 BECC对大鼠在倒时差条件下心脏生物钟基因的影响

心脏中也存在着子钟,调节效应器的节律。因此,我们也检测了心脏中生物钟关键基因Bmal1、Cry1在颠倒光周期后第3 d、第5 d的节律表达,结果见图3,统计学分析结果见表3。如图3所示,第3 d时,与Control组相比,Bmal1与Cry1基因在Normal组中的表达水平峰值未移动,但在BECC组中分别移动了8 h与12 h。第5 d时,Bmal1与Cry1基因在BECC组中已经完成时相重置,但在Normal组中只移动了8 h与4 h。如表3所示,BECC组中Bmal1基因表达峰值与Control组相比发生了明显的移动,且均呈现节律性表达;Cry1基因表达峰值与Control组相比发生了明显的移动,但节律性消失。

图3 BECC在倒时差条件下对心脏生物钟基因重置的影响Fig.3 The effects of BECC administration on the reset原ting processes of clock genes in the heart of rats after the experimental jet lag

2.3 BECC对大鼠在倒时差条件下行为活动的影响

为了进一步观察颠倒光周期后大鼠生理行为能力的变化,以及服用BECC后是否能增强大鼠对外界变化环境的适应能力,本实验监测了大鼠颠倒光周期前后的活动行为。如图4所示,Normal组和BECC组中大鼠的行为动作节律重置结果相近。在对照组的光照条件下,大鼠夜间的活动量(约占总运动量的80%)是白昼活动量(约占总运动量的20%)的近4倍。新的光照周期条件下,BECC组和Normal组前3 d的暗期活动量一直明显少于对照组,且颠倒光周期后的Normal大鼠大约需要5 d才能恢复到正常光周期大鼠的活动量;与Normal组的大鼠相比,BECC组的大鼠在第4 d时昼夜活动量已恢复,且在第1 d与Normal组相比有显著的加快。

3 讨论

在本实验中,我们探讨了BECC对人为时差条件下哺乳动物生物钟的影响,包括外周生物钟基因的表达水平和行为活动节律的变化。我们发现,BECC能够加快外周组织中(肝脏、心脏)生物钟基因的节律重置。

在肝脏中,BECC对Bmal1基因峰值相位移动的重置体现出了积极的促进作用,如表4所示,由于延长光照时间所产生的12 h时差,Normal组需要5 d才能完成相位的重置,即凭借自身的调控机制,机体需要5 d才能适应新环境,但是BECC组中Bmal1基因仅需要3 d就能完成重置。Cry1基因峰值相位移动情况差异不大,但是从重置过程分析,颠倒光周期的第3 d,BECC组的峰值就已移动了8 h,而Normal组的峰值相位在第3 d仅移动了4 h,在第5 d才达到BECC组第3 d的移动水平。通过以上重置过程的比对分析可知,BECC对肝脏中Cry1基因的重置也是有一定促进作用的。

表3 BECC对大鼠心脏中生物钟基因表达的影响Table3 Effect of BECC administration on rhythmic expression of the clock genes in rat heart

图4 BECC对大鼠在倒时差条件下行为活动的影响Fig.4 Effects of BECC administration on resetting of the locomotor activity rhythm

在心脏中,BECC组大鼠生物钟基因的重置速度明显比Normal组迅速,如表3所示,Bmal1和Cry1基因峰值相位移动在两组中的变化均存在明显的差异。在BECC组中,Bmal1基因在第3 d时就明显移动了8 h,到第5 d就完成了重置,而Normal组中Bmal1的峰值相位在颠倒光周期后的第3 d几乎没有移动,直至第5 d才移动8 h;另外,BECC组中,Cry1基因在第3 d就完成了重置,而Normal组在第5 d也仅移动了4 h。由此可见,服用BECC能够加速紊乱生物钟的重置,有效地促进机体对新环境的适应。

哺乳动物的生物钟系统由位于下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)的母钟和分布于外周各组织、器官的子钟所构成[10]。行为活动是生物钟母钟SCN的输出信号之一,行为活动节律能够反映母钟SCN的重置情况[11]。本实验检测了光周期颠倒后各组大鼠的行为活动情况。实验结果发现,与Normal组相比,BECC组大鼠行为活动节律恢复速度略有加快,尤其是在光和食物周期颠倒后的第1 d(图4),由此可见,BECC对大鼠母钟SCN也有一定的调控作用,将来进一步对母钟节律以及其他相关输出信号的研究能有助于更好地阐明BECC对生物钟系统的调控作用。

BECC中的活性成分与生理功能存在着密切的联系,经成分分析,L-肌肽(L-carnosine)是BECC的主要作用成分之一,由β-丙氨酸和L-组氨酸组成,是广泛存在于多种脊椎动物骨骼肌和大脑中的内源性二肽[12]。发现至今,L-肌肽被证实有多种生理功能。L-肌肽能够捕捉自由基、抗衰老、螯合金属离子、缓冲生理pH,并能抑制由转运金属、血红蛋白、单线态氧、脂氧合酶、自由基等催化的脂类氧化[13],保护细胞免受氧化损伤、抑制细胞老化、恢复衰老细胞活力[14],同时还具有神经保护和血管舒张等作用[15]。2007年,Tanida等[16]证实L-肌肽在生物钟母钟信息传递过程有重要作用。因此,BECC能够加快大鼠适应由光周期颠倒引起的时差反应可能在一定程度上是通过其中的L-肌肽发挥作用的。

表4 生物钟基因表达峰值的相位移动Table4 The phase shift of clock gene expression compared with the control group

在生物钟分子机制的反馈回路中,CLOCK/NPAS与BMAL1形成的CLOCK/BMAL1或NPAS/BMAL1二聚体与E-box结合,调控Per和Cry基因表达,同时抑制这些异源二聚体启动的Reverbα、Dbp等基因的转录,影响下游一系列钟控基因的表达[17～19]。Mongrain 等[20]研究指出,在睡眠紊乱的小鼠中,BMAL1/CLOCK和NPAS结合到Per1和Dbp启动子上的程度发生了显著的变化,而L-肌肽可能通过改变两者的结合程度来加快生物钟子钟的重置。研究L-肌肽在分子水平上对生物钟基因的调控作用,将有助于进一步阐明BECC对生物钟调控的分子机制。

需要指出的是,本实验仅研究了BECC对部分生物钟子钟基因在转录水平的调控作用,进一步对母钟和其他子钟以及其他生物钟基因表达的研究,可以更加全面地解析BECC在生物钟调控方面的作用。另外,通过对大鼠相关生理代谢水平及其调控机制的研究,将有助于阐明BECC作为缓解时差反应的功能性食品的潜在可能性。

综上所述,本研究通过短期颠倒光周期,破坏内源性昼夜节律,构建大鼠时差模型,同时外源补充BECC,采用红外探头监测大鼠每日行为活动,荧光定量PCR分析外周组织(肝脏和心脏)中生物钟基因转录水平,从生理内外表象、基因转录水平层面研究了BECC对大鼠在短期倒时差情况下适应环境与维持代谢稳态的作用效果,实验结果发现,外源服用BECC后,能有效地加快生物钟基因的重置。因此,BECC作为一种功能性食品,在一定程度上可以预防和缓解由快节奏生活引起的生物钟紊乱所导致的生理不适,但BECC作为功能性食品在其他方面的影响仍需继续研究。

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