ATP及P2X7受体在三伏灸治疗支气管哮喘的作用机制研究※

陈 铭 康佩芝 董亚琴

（1福建卫生职业技术学院临床医学系，福建 福州 350101；2福建省中医药研究院福建省经络感传重点实验室，福建 福州 350003）

支气管哮喘是常见的慢性疾病之一。我们前期的实验则表明三伏灸可通过抑制MMP-9的合成，使支气管哮喘新西兰兔细支气管平滑肌厚度及细支气管内管壁厚度明显变薄，从而显著改善气道重塑现象而达到治疗效果[1-2]。本文通过进一步观察三伏灸对ATP和P2X7受体的影响，探讨三伏灸治疗支气管哮喘的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 新西兰兔18只，雄性，体质量 （2.5±0.3）kg，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK （闽） 2012-0001。

1.1.2 试剂、药物及仪器 卵白蛋白 (Ovalbumin，OVA)（美国Sigma公司）；氢氧化铝 (Aluminum hydroxide，AL(OH)3) （西陇化工股份有限公司）；异氟烷 （瑞沃德公司）；甲醇 （色谱纯，默克股份两合公司），磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 （色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司），ATP、ADP、AMP、ADO （西格玛奥德里奇上海贸易有限公司），实验用水超纯水；RNA提取液（武汉谷歌生物科技有限公司）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（HyClone公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo公司）；FastStart U-niversal SYBR Green Master(Rox) （Roche公司）； 引物（武汉谷歌生物科技有限公司）P2RX7上游引物：5’-CCACAGTCTCAATCACCCACAA-3’，下游引物：5’-CCACACATCCTCCCCTATCC-3’，待扩增产物长度191bp。GAPDH上游引物：5’-CCGCCCAGAACATCATCCCT-3’，5’-GCACTGTTGAAGTCGCAGGAGA-3’， 待扩增产物长度262 bp。

ACQUITY超高效液相色谱仪 （waters公司）；SB-5200DT超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）；BP211型电子天平称 （德国Sartorius公司）；DL-200微型掌上离心机 （北京东林昌盛生物科技有限公司）；ESP-32微透析注射泵 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司），瑞沃德呼吸系统 （瑞沃德公司）。匀浆仪（康涛科技）；台式高速冷冻型微量离心机 （DragonLab公司）；荧光定量PCR仪 （ABI公司）；超净工作台 （苏净安泰公司）；超微量分光光度计 （Thermo公司）；标准试剂型纯水仪 （青岛富勒姆科技有限公司）。

1.2.1 动物分组、造模及干预方法 18只新西兰兔适应性饲养1周后，采用随机数字表法随机分为空白组，模型组，治疗组，每组6只。除空白组外，其他2组制备成哮喘模型。动物模型制造：在第1、8天腹腔注射1 mL OVA (卵白蛋白)/AL(OH)3混合液 (含OVA 10 mg和AL(OH)3200 mg)致敏，第15天开始应用超声雾化器于自制简易雾化箱中以一定浓度的OVA生理盐水溶液雾化激发，每次20 min，隔日1次，持续30d。激发浓度分别为前15 d的1%，后15 d的1.5%。空白组在第1、8天给予生理盐水代替OVA/AL(0H)3混合液腹腔注射，第15天开始以生理盐水代替OVA超声雾化吸入， 每次20 min，隔日1次，持续30 d。

治疗组给予三伏天隔姜灸联合中药敷贴 （白芥子、细辛、甘遂、延胡索等研末，治疗前1天用姜汁及凡士林调成膏状备用），穴位选择大椎及双侧肺俞，置以直径约0.8 cm、厚约0.3 cm的鲜生姜片，在姜片上放置底面直径为0.6 cm的圆锥形艾柱 (约为1 g)艾灸，3壮后分别敷贴外敷药4 h。于致敏后第15天 （初伏）雾化前0.5 h干预，隔日1次，连续30 d。

1.3 观察指标及检测方法

1.3.1 腧穴ATP含量检测

1.3.1.1 实验样品收集方法及标准溶液的制备 接好微透析注射泵和微透析管路，选用生理盐水为灌流液，灌流速度为2 μL/min。使用麻醉剂为异氟烷的麻醉呼吸机，以5 cc/min×5的量将兔子麻醉诱导，定位大椎穴和肺俞穴，用留置针穿刺皮肤并将留置针的外套管留于皮肤内，借助外套管，将已用超纯水浸泡过的线性探针的半透膜植入大椎穴和肺俞穴，将线性探针的入口端与微透析泵管路连接，出口端装入EP管中，进行腧穴区透析液的收集，同时将麻醉量降至5 cc/min×2.5进行麻醉维持。前1 h的透析液不收集，1 h后，每20 min一管，共收集3管，标记后放-80℃冰箱保存。高效液相色谱测定时，取出解冻后再放入离心机中离心2 min，用移液枪吸取3管混合打入1个进样瓶中进行测定。

精密称取ATP、ADP、AMP、ADO标准品各10 mg，加10 mL生理盐水配制成1mg/ml的混合标准液，然后加生理盐水，配制成系列浓度的混合标准液，浓度从低到高依次为： 0.05、 0.1、 1、 10、 50、 100 μg/mL。 为减小误差，进行平行试验，每次不同浓度的混合标准液都配制两管。

1.3.1.2 色谱条件 色谱柱： Waters ACQUITY UPLC C18色谱分析柱 (1.7 μm， 2.1×100 mm)

流动相：C相为甲醇，D相为50 mmol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾组成的磷酸盐缓冲液 (pH=6.8)，采用梯度洗脱，0～0.85 min时，流速为0.3 mL/min，5%的C相和95%的D相；0.85～0.86 min将流速降至0.1 mL/min；0.86～4.0 min时，维持0.1 mL/min流速，5%的C相和95%的D相；4.0～4.1 min，将流速升至0.3 mL/min，C相升至20%，D相降至80%；4.1～6.0 min时，维持0.3 mL/min流速，20%的C相和80%的D相；6.0～6.1 min，将流速维持0.3 mL/min，C相降至5%，D相升至95%；平衡至10 min结束。

柱温为25℃，检测波长259 nm，进样量5 μL。

1.3.2 肺组织P2X7受体mRNA表达

1.3.2.1 总RNA的提取 取匀浆管，加入1 mL的Trizol Reagent，置冰上预冷；取100 mg肺组织，加入到匀浆管中；匀浆仪充分研磨直至无可见组织块；12000 rpm离心10 min取上清；加入250 μL三氯甲烷，颠倒离心管15 s，充分混匀，静置3 min；4℃下12000 rpm离心10 min；将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀；-20℃放置15 min；4℃下12000 rpm离心10 min，管底的白色沉淀即为RNA；吸除液体，加入75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀；4℃下12000 rpm离心5 min；将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3 min；加入15 μL无RNA酶的水溶解RNA；55℃孵育5 min；使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μL待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测；将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200 ng/μL。

1.3.2.2 实时荧光定量PCR反转录 取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液； 加入1 μL oligo(dT)18； 用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μL；于PCR仪上65℃保温5 min，迅速置冰上冷却；依次加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制剂 （20 U/μL) 和1 μL RevertAi M-MuLV逆转录酶(200 u/μL)，用枪抽吸混匀；于PCR仪上42℃保温60 min，结束后70℃保温5 min灭活反转录酶。定量PCR：取0.2 mL PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5 μL， 7.5 μM基因引物2.0 μL， 反转录产物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL； PCR扩增， 预变性95℃10 min；循环 （40次）95℃，15 s→60℃，60 s；熔解曲线60℃→95℃，每15 s升温0.3℃。

1.3.2.3 结果处理方法 △△CT法：每个标本重复3次，Ct值取平均值；△CT=CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)；△△CT=△CT(待测样本)-△CT(对照样本)； 表达倍数=2-△△CT。

1.4 统计学方法 计量资料用 （）表示，采用SPSS 20.0统计分析，进行正态检验，符合正态分布，多组比较用单因素方差分析，2组组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布，采用独立样本秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大椎穴和肺俞穴ATP浓度检测 表1。

表1 新西兰兔大椎穴和肺俞穴ATP浓度 （，μg/mL）

表1 新西兰兔大椎穴和肺俞穴ATP浓度 （，μg/mL）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

组别空白组模型组治疗组只数6 6 6大椎穴ATP浓度 肺俞穴ATP浓度0.3950±0.0409 12.4150±1.2662 5.2417±0.9637 0.4650±0.0774 10.2986±0.9360△4.3400±0.9586#

2.2 肺组织P2X7受体mRNA表达 见表2。

表2 新西兰兔肺组织P2X7受体mRNA的相对表达量 （）

表2 新西兰兔肺组织P2X7受体mRNA的相对表达量 （）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

相对表达量0.1462±0.0785 3.3615±0.0254△1.1713±0.0153#组别空白组模型组治疗组只数6 6 6

3 讨论

哮喘是一种慢性气道性炎性疾病，其发生与发展和气道炎症反应有着密切联系。ATP是细胞不可缺少的能源物质，参与了细胞内各种代谢循环，同时它可由突触释放并作为突触传递重要的神经递质；还可由血小板、上皮细胞和嗜碱性粒细胞等释放出来，通过自分泌到胞外与细胞表面的特异性受体结合，参与调节了多种细胞反应。研究表明[3-7]：ATP可对呼吸道产生多重影响，从而影响哮喘的发生及发展。ATP参与离子的跨膜转运，促进呼吸道黏膜纤毛清除能力，维护肺部的宿主防御功能；作为一种重要的神经递质或自分泌/旁分泌信使，不仅可促使呼吸道平滑肌的收缩，还可诱发呼吸道平滑肌上皮依赖性的舒张，显示其复杂的双重调节作用；是呼吸道疾病和炎症发生的重要介导者，过量释放将导致炎症反应的加剧，对于哮喘的发生与发展起促进作用。本次实验观察到模型组腧穴区ATP的浓度显著高于空白组，也表明ATP参与了支气管哮喘的发生发展过程。

ATP的作用大多是通过激活细胞表面的特异性受体实现的，众多受体中P2X7受体被认为是最特殊的受体。P2X7由595个氨基酸组成，是一种2次跨膜的蛋白，其N端和C端均在细胞内，在细胞膜上可形成3个或更多个同源亚基复合体。它与其他P2X受体的不同在于P2X7位于胞内的有239个氨基酸，显著多于其他已知ATP受体亚型梭基端氨基酸数量 （27～129个），此结构基础决定了P2X7功能的特异性。P2X7受体的持续激活将导致大的膜孔形成，使得相对分子质量为800×103的大分子都可以自由通过，最终导致细胞死亡，因此P2X7受体也被称为P2Z受体，即细胞死亡受体[8]。大量实验证明人类P2X7基因调节哮喘中气道对感染的反应，P2X7基因所在的染色体基因位点包括许多和哮喘肺功能相关的基因。Denlinger等[9]研究表明，ATP的释放是气道炎症反应细胞损伤过程中的一种有害信号，在人和小鼠过敏原激发后，气道ATP水平升高，引发树突状细胞合成促进嗜酸粒细胞和淋巴细胞募集的细胞因子，导致气道高反应性和气道炎症反应，而P2X7受体参与了ATP释放的调控过程，阻断P2X7可以减轻OVA激发的树突状细胞介导的嗜酸粒细胞和淋巴细胞浸润。本次实验观察到模型组肺组织P2X7表达显著高于空白组，表明P2X7受体参与了支气管哮喘的发生发展过程。ATP可能是通过P2X7受体参与了支气管哮喘的发生发展过程。

三伏灸是以 《内经·四气调神大论》提到的 “圣人春夏养阳， 秋冬养阴， 以从其根”[10]为理论依据的一种治疗方法，利用天阳、艾之辛阳之性以及药物的温阳、辛散、走窜作用通过穴位的特异性温补脾肾、温阳散寒，从而增强患者体质，减少支气管哮喘的发作次数。近几年，三伏灸在南方许多城市流行，在临床上取得较为显著的疗效，得到了患者及其家人的普遍认可。本次实验观察到治疗组腧穴区ATP的浓度和P2X7表达显著低于模型组，表明：三伏灸可能通过下调局部穴位ATP的浓度，进而下调肺组织P2X7受体的表达量，从而改善炎症反应达到临床疗效。

[1]文婧，苏美玲，李淑娟，等.三伏灸不同灸量对支气管哮喘新西兰兔细支气管形态的影响[J].中华中医药杂志，2017，32(11):4932-4935.

[2]陈铭，苏美玲，文婧，等.三伏灸不同灸量对哮喘型新西兰兔MMP-9表达的影响[J].中国中医药现代远程教育，2017，15(17):143-145.

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