五倍子提取物在南美白对虾养殖中的应用研究

（长沙学院 生物与环境工程学院，湖南长沙 410000）

五倍子是瘿棉蚜科（Pemphigidae）五节根蚜亚科（Fordinae）某些蚜虫寄生在漆树科（Anacadi-aceae）盐肤木属（Rhus L.）几种树的复叶上形成的一类虫瘿[1]。其主要的化学成分为1分子葡萄糖和6～8个分子没食子酸缩合的五倍子鞣质，含量大多为60%～70%，有一些可以高达80%，而且含没蜡质、食子酸2%～4%、树脂、脂肪等，还有若干缩合没食子鞣质[2]。药理学表明，除了抗氧化、抗菌等提到的作用，五倍子的提取物对很多种肿瘤细胞具有抑制作用[3]。

南美白对虾是目前世界上养殖产量最高的三大虾类之一[4]。其肉质具有丰富的营养物质，如高蛋白质，多种氨基酸，肉质元素组成非常理想，种类繁多的矿物元素，还含有许多种必需的维生素，具有较高的营养价值[5]。所以南美白对虾是一种有着非常好的养殖前景的对虾种类，并且值得大力推广开发利用与养殖。近年来由于沿海病毒的危害，造成南美白对虾的减产，严重影响了其养殖效益。其中副溶血弧菌是最主要的病毒。副溶血弧菌在盐水中的生长繁殖状态最好，所以又叫嗜盐菌，通常会在海水、淤泥以及水产动物体内生长繁殖。主要感染海产鱼、虾、蟹、贝等的水产动物，引起鱼类皮肤溃烂、虾红体病等，是水产养殖业中最主要的致病菌之一，人体食用的水产动物如果被副溶血弧菌感染，可引起腹泻、肠痉挛等急性肠胃病，甚至死亡[6]。副溶血弧菌已成为人类食用海产品导致食物中毒的主要病因[7]。本文采用水提和醇提两种方法提起五倍子有效成分，并研究其对副溶血弧菌的抑制作用，为南美白对虾的健康养殖提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验对虾品种：南美白对虾，由广东粤海饲料集团提供

南美白对虾饲料：由广东粤海饲料集团提供

五倍子：市场药店购买

试验菌株：副溶血弧菌ATCC17802

1.2 实验方法

1.2.1 五倍子有效成分的提取

取洗净干燥的五倍子粉碎，称取25g五倍子粉末置于1000ml的烧杯中，加入500mL的75%乙醇，混匀。超声萃取30min，功率240W。抽滤，弃滤渣，旋转蒸发浓缩至25ml，真空冷冻12h，得固态五倍子提取物，保存备用。

1.2.2 不同浓度梯度五倍子提取物的配制

取已灭菌的EP管，将水提和醇提五倍子提取物分别配制成1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml、0.0625g/ml、0.03125g/ml浓度梯度。

1.2.3 南美白对虾养殖前期准备

南美白对虾的养殖实验在长沙学院室内养殖基地进行，养殖缸大小为120cm×80cm×80cm，用高锰酸钾溶液消毒。用粗盐将养殖缸中水体盐度调配至与虾苗场相同的盐度。监测及调节水体渗透压、水体温度、pH、溶氧、氨氮、亚硝酸盐以及硫化氢等指标。使水体达到最佳养殖条件，具体指标如下：pH7.8～8.4、溶氧量＞6mg/L、水体温度22℃～28℃。

饵料投喂方法：虾片饲料用60～80目尼龙筛过滤，均匀泼洒投喂。每万尾虾苗每次投喂20～30g，100～150g/d，投喂4～6次/d，必要时可增投1～2次，每天递增饲料15%-25%。根据虾苗密度、规格大小、水质、虾苗的摄食情况和肠胃饱满度以及虾苗是否出现饥饿性浮头等情况适当调整。

1.2.4 副溶血弧菌的活化

将实验室保存的副溶血弧菌ATCC17802冻干粉，接种于2216E液体培养基中，摇床培养活化处理，温度28℃、转速180r/min。

1.2.5 五倍子水、醇提取物饲料对副溶血弧菌的抑制作用

（1）副溶血弧菌最低致病浓度试验

在南美白对虾养殖系统中，加入不同浓度的副溶血弧菌，形成相应的浓度梯度（表1），试验副溶血弧菌最低致病浓度，通过统计南美白对虾的生长状况及成活率，得出弧菌对南美白对虾的最低致病浓度。

表1 副溶血弧菌浓度梯度表

（2）五倍子水、醇提取物饲料的制备

将五倍子水、醇提取物均分别按照0.5%、1%、2%的浓度含量均匀地喷洒在饲料表面，然后混匀、烘干，保存备用。

（3）五倍子水、醇提取物不同浓度下对副溶血弧菌的抑制作用

五倍子提取物在杀死细菌的同时对南美白对虾也具有毒副作用，为研究五倍子同一提取条件下，不同浓度中的最佳抑菌效果，并且毒副作用最小，实验设计如下。

将已经制备好的五倍子水、醇提取物饲料分别分成4组（即：普通饲料、0.5%水提取饲料、1%水提取饲料、2%水提取饲料；普通饲料、0.5%醇提取饲料、1%醇提取饲料、2%醇提取饲料）进行投喂，连续投喂5d、10d、20d后，将副溶血弧菌加入南美白对虾养殖缸中，使养殖缸中的副溶血弧菌浓度达到1×10-8cfu/ml，此浓度是自然界副溶血弧菌治病的较高浓度，所以选用此浓度模拟自然界的弧菌治病浓度，能很好地体现出五倍子的抑制效果，统计7d内南美白对虾的生理情况。

2 结果与分析

2.1 副溶血弧菌最低致病浓度结果

副溶血弧菌可以使南美白对虾患病（表2）

由表2可知，从第5组（1×10-5浓度）开始出现对虾的死亡。随着副溶血弧菌的浓度升高，南美白对虾的死亡数量增大，可以得知副溶血弧菌最低致病的浓度为1×10-5cfu/ml。

2.2 比较五倍子水、醇提取物饲料对副溶血弧菌的抑制作用

不同浓度五倍子水、醇提取物饲料投喂5d、10d、20d的效果：

图1 不同浓度水提取物饲料投喂效果

图2 不同浓度醇提取物饲料投喂效果

根据图1，图2中显示的南美白对虾死亡数量可得，五倍子水提取物饲料组中，含量为1%的抑菌效果最好；而五倍子醇提取物饲料组中，含量为0.5%的抑菌效果最好。连续喂养五倍子提取物饲料5d抑菌效果最佳。

2.3 五倍子提取物直接投放对副溶血弧菌的抑制作用

直接投放五倍子提取物所产生的抑菌效果如下（表3）

由表9可知，在养殖7天后，对照组死亡8只，活跃程度偏低。0.05%五倍子水提取物组死亡6只，活跃程度适中，没有很大影响。0.1%五倍子水提取物组死亡6只，活跃程度偏低。0.2%五倍子水提取物组死亡8只，活跃程度偏低。0.3%五倍子水提取物组死亡9只，活跃程度偏低。0.4%五倍子水提取物组死亡10只，活跃程度偏低。0.5%五倍子水提取物组死亡10只，活跃程度偏低。0.6%五倍子水提取物组死亡10只，活跃程度偏低。

综上所述，在养殖7d后，直接投放五倍子提取物对南美白对虾的抑菌效果比将五倍子提取物混入饲料中的效果相对较差，并且大于0.05%五倍子水提取物组死亡率高。可以看出，五倍子直接投喂具有一定的毒副作用，并且毒副作用比将五倍子提取物混入饲料中投喂要大很多。

2.4 结论

（1）副溶血弧菌最低致病的浓度为105cfu/ml。

（2）五倍子水提取物饲料中，含量为1%的五倍子水提取物饲料具有最好的抑菌效果。而醇法提取中，含量为0.5%的提取物具有最佳的抑菌效果。

（3）五倍子提取物直接投入含副溶血弧菌的水体中，对弧菌有一定的抑制效果，但没有拌喂饲料效果好。

（4）连续喂养五倍子提取物饲料5d抑菌效果最佳，连续喂养10d以上会产生毒副作用，可以连续投喂5d，间隔投喂。

3 讨论

研究表明，五倍子具有非常好的防病杀菌的作用，具有清除自由基、抑菌、抗病毒、抑突变、抗氧化等药理作用。主要起成效成分为单宁酸（Tannin Acid），又称鞣质、鞣酸、丹宁[8，9]。Sunny O.A 等研究没食子酸可有效防止机体脂质过氧化反应，可作为机体自由基的清道夫[10]。Nalan Yilmaz S等报道五倍子有治疗抗蛇毒、白带、帕金森病、腹泻等作用，也作为皮革鞣、杀虫剂、剂局部麻醉剂使用[11]，其所含的水解单宁可以在酶、碱、酸作用下水解成没食子酸。而本实验所需提取的有效成分就是没食子酸。由大量的体外实验表明，五倍子提取物对副伤寒杆菌、绿脓杆菌、肺炎球菌、链球菌、金黄色葡萄球菌以及伤寒杆菌、炭疽杆菌、痢疾杆菌、白喉杆菌等均有明显的杀菌或抑菌作用。临床研究表明五倍子佐以甲硝哇、庆大霉素能增强杀菌效果，特别对厌氧菌、铜绿假单抱菌的作用非常显著，五倍子还对羊毛样抱子菌等等的真菌也是有较强的抑制作用[12]。

表2 副溶血弧菌浓度梯度效果表

表3 不同浓度五倍子提取物对弧菌的影响

本实验本试验采用纯水和乙醇不同形式的方法提取五倍子，探讨不同方法提取的五倍子提取物对副溶血弧菌的抑制效果及其在南美白对虾养殖中的应用。实验首先探究出南美白对虾感染副溶血弧菌的最低浓度为10^5cfu/mL。用两种方法提取五倍子提取物来分别探究五倍子提取物浓度、是否直接投放、喂养天数对南美白对虾的养殖影响，两种方法对比并找出对南美白对虾毒副作用最小的方法、抑制副溶血弧菌的最佳效果与浓度。实验结果表明：五倍子水提物和五倍子醇提物均能起到抑制副溶血弧菌生长繁殖的作用；五倍子水提物能更好地抑制副溶血弧菌的生长繁殖。五倍子水提取物饲料中，含量为1%的五倍子水提取物饲料抑菌效果最好。五倍子醇提取物饲料中，含量为0.5%的五倍子醇提取物饲料抑菌效果是最好的。相同条件下五倍子水提取物比纯提取物抑制效果好。五倍子提取物直接投入含副溶血弧菌的水体中，对弧菌有一定的毒副作用，但没有拌喂饲料效果好。在饲喂时间上，连续喂养五倍子提取物饲料5天抑菌效果最佳，连续喂养五倍子提取物饲料10天以上会产生毒副作用，可以连续投喂5天，间隔投喂。五倍子水提取在南美白对虾养殖过程中具有很好的抑菌效果，能抑制副溶血弧菌生长繁殖从而应用到水产养殖中，有效的控制疾病的发生。

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