3种奶牛乳腺炎常见致病菌多重PCR检测方法的建立

（江苏省张家港市金港镇动物防疫站，江苏张家港 215600）

对于奶业的发展来说，乳腺炎可以说是危害极为严重的，而且是在全球范围广泛存在的，很容易导致严重的经济损失。究其原因的话，主要就是由于病原菌导致乳腺组织遭受感染，进而出现一定程度的损伤，最终对奶的产量和品质产生不良的影响，有时候也会导致一些临床症状的出现。

1 奶牛乳腺炎常见致病菌多重PCR检测方法的研究与分析

对于临床标本病原菌的检验方式，目前所采用的检验方法依然是培养法，也就是说等到标本的采集完成了以后，先通过增菌培养液达到增菌的目的，等到有阳性结果呈现的时候，再进行单个菌落的分离，结合形态学、生理学、免疫学等进行确诊。这种方法准确度比较高，但是时间消耗是比较长的，所以从临床的需求来看，是无法很好满足实际要求的。还有一个问题就是，病原菌在刚刚侵袭的时候，细菌的数量是比较少的，或者说只有当乳中有大量淋巴细胞或者体细胞出现的时候，能够引起临床感染症状，这样的话，传统细菌学培养可能呈现阴性。PCR方法的出现可以说是恰好能够弥补细菌学培养的不足，也逐渐成为乳腺炎病原菌鉴定的一种有效方法。这种检测方法最为典型的特点是样品剂量少，检测时间比较短，这也是能够在临床上广泛应用与推广的重要原因。

2 关于奶牛乳腺炎常见致病菌多重PCR检测方法建立的研究与分析

2.1 研究的材料与方法

在实验中会用到菌株、培养基以及相关的试剂，其中各类对照菌种是由某大学微生物实验室所提供的，所用到的试剂盒主要就是DNA回收试剂盒以及质粒DNA提取试剂盒，是由上海某公司所提供的；另外，还需要用到PCR试剂盒，实验中的增强剂是从北京某公司所购买的，载体等均是从某生物工程公司购买的。

在实验的过程中，需要做好三种主要致病病原菌种的分离与鉴定，步骤基本是相同的，首先需要做好的培养基的分离工作，然后进行生化性鉴定，最终完成分离与鉴定，确定是否就是这种菌种。

2.2 样本的采集

样品主要是源于当地的六个奶牛养殖场，进行了临床乳腺炎奶样的采集，样本的总数量是34份。乳腺炎一旦有了临床的症状表现，往往就是挤奶的工作人员在工作过程中所发现的，在进行样本的采集之前，需要首先做好清洁工作，采样后立即送实验室检查，注意时间的间隔不能够超过24h。

2.3 引物的设计

引物设计的主要原理就是金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的序列位于16SrRNA和23sRNA之间，同时进行了片段的扩增，针对两对引物，片段分别扩增了420bp和270bp，而酵母菌的片段扩增长度则是730bp左右。

首先，关于金黄色葡萄球菌

其次，关于无乳链球菌

第三，关于酵母真菌

2.4 PCR的特异性检测

关于PCR的特异性检测，主要就是通过对实验设计的3对引物，对于不同类型的细菌分别进行PCR的扩增，除了无乳链球菌、酵母菌以及金黄色葡萄球菌有扩增出目的条带，其余都没有，这样的话，就可以表明这种方法的特异性表现是比较理想的。

图 不同种类对照细菌的PCR扩增

2.5 多重PCR牛乳腺炎检测方法的建立

由于受到退火温度、退火的具体时间以及反应条件等多重因素的影响，最终对于多重PCR反应而言，最佳的反应条件应该是这样的：首先预变性应该是在94℃条件下发生的，时间应该是三分钟，然后变性同样是在94℃的条件下进行的，只是时间仅仅是1min，然后等到温度降低到57.5℃的时候，开始退火，时间是40s，在温度是72℃的条件下进行延伸，时间是40s，这样的循环在进行36次之后，在72℃的温度条件下进行反应，时间是10min。

2.6 多重PCR的敏感性检测

从多重PCR的敏感性检测结果来看，在经过了生理盐水稀释处理之后，无论是对于金黄色葡萄球菌，抑或是无乳链球菌，以及酵母真菌来说，多重PCR的最小检测浓度都是相同的，但是对于牛奶中不同菌种检测的最小浓度是有所差异的。

图PCR的扩增分析

2.7 多重PCR对乳腺炎临床样品的检测

通过已经建立的多重PCR检测体系，对于34份样本进行了检测，从检测的结果来看，这种检测方法是高效快速的，是能够有效检测出致病菌种的。

3 讨论

文章主要就是通过试验建立了多重PCR的方法，主要目的就在于希望能够对于导致奶牛感染乳腺炎的三种致病病菌进行检测，分别是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌以及酵母菌，在实验的具体过程中，对于PCR模板的制备主要是运用了两种方法，在运用CTAB方法对其进行抽提的时候，如果是从奶样中进行抽提的话，为了保证预期的良好效果，需要首先对样品进行洗涤，而且洗涤最好要充分一些，主要目的是为了将钙离子去除，尽量避免其可能导致的影响。

相对于常规的方法来说，多重PCR是同时涉及多个模块和多对引物的，这样的话，可能对其产生影响的因素也是比较多的。需要注意的是，在进行多重PCR检测方法建立的实际过程中，最为关键的就是引物的设计，总的来说，引物不仅仅应该具有较强的特异性，而且对于引物的含量应该是大致相同的，解链的时候，对于温度的要求基本是相同的，这样的话，如果退火温度相同的话，那么虽然基因的片段不同，但是扩增的效果都是比较理想的。

还有一点必须认识到，就是扩增得到的产物如果经过琼脂糖凝胶电泳处理之后，分带是清晰的，也就是说，扩增片段不仅仅存在大小的差异，而且是能够清晰加以辨别的。

最后就是对于引物之间可能存在的关系，必须予以充分考虑，这样的话能够有效避免二级结构的形成，否则就很容易导致多重扩增失败或者是呈现出假阳性，进而导致错误的结果。

对于多重PCR来说，之所以需要对其反应条件进行优化，主要的原因就是为了寻求不同引物浓度在不同的反应体系中的最佳配比，实现引物浓度的平衡，最终保证任意一个靶位点都能够得到足够的扩增值。

还有一点就是要想实现多重PCR扩增效率的提升，就要在适当的程度范围内增加模板的浓度以及聚合酶的浓度，如果扩增的效率并未因此得到改善的话，最好是能够让引物的浓度得以成倍增加，主要的举措就是复性和延伸的温度依次降低。

如果在实验的过程中，出现了比较严重的非特异性扩增，那么必须首先通过一些常规的方法对引物进行确定，明确是由于哪一对引物的存在而导致的这种非特异性扩增，然后对引物进行重新设计。

事实上，在引物的选择上，所选择的三对引物在扩增片段的长度方面，差异并非显著，通过浓度为1.5%的琼脂糖电泳就能够加以区分。既然扩增的片段补偿，那么在进行模板制备的时候，选择水煮法就是可以的。另外，可以选择适当区间序列作为扩增的目的片段，主要目的就是为了提升PCR的阳性检出率。

事实上，从临床的检测结果来看，如果是对于已经采集到的34份奶样同时使用传统方法和二重以及三重检测方法进行检测的话，会发现相对于传统的细菌学方法来说，无论是二重，抑或是三重，检出的符合率都要更高一些，而且通过PCR方法的检出率明显要高于细菌学的检测方法。

另外，在实验的过程中发现，如果是对多重PCR反应体系进行优化的话，方法快速、准确、科学，优化的效率得到显著提升。事实上，能够对多重的PCR反应产生影响的因素有很多，例如引物的使用量等，研究表明，引物的使用量和产物的大小是成正比例的。

对于奶牛的养殖来说，乳腺炎可以说是一种极为常见的疾病，而且其主要的致病原因就在于多重病原菌对于奶牛乳腺组织的侵袭所导致的，这其中金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌等都是奶牛乳腺炎最为主要的致病菌种，通过对当地几个规模化奶牛场乳腺炎进行细菌的分离与鉴定，明确这三种菌种在当地牛场的分布情况，再针对三种不同的菌种，依托软件，立足实际，进行了三对特异性引物的设计，在此基础上，建立了多重的PCR反应体系，同时对其进行科学和合理的优化，实现多重PCR反应体系效率的显著改善与提升。

通过实验发现，运用传统的方法对细菌进行分离与鉴定，结果发现三种致病病原菌在奶牛场是广泛的存在的，只是检出率略有差异，其中无乳链球菌检出率是最高的，金黄色葡萄球菌次之，而酵母菌的检出率相对于其他两种菌种而言，是比较低的。在感染的方式方面，金黄色葡萄球菌单独感染率将近5%，无乳链球菌的单独感染率将近18%，而酵母菌是不会单独发生感染的，混合感染率则将近78%。

虽然随着奶牛养殖规模的不断扩大，当地规模化养殖场的数量日趋增多，但是由于在饲养管理方面依然延续了传统的、粗放式的手段，再加上长期的挤奶等操作很容易导致乳腺组织处于高负荷的运转情况下，抵抗力不断下降，感染的概率大大增加；再加上管理不够科学，不够规范，卫生条件不理想，环境细菌超标现象严重，可以说都为各种奶牛乳腺炎主要致病菌的生长和繁殖提供了生长与繁殖的条件。

综上所述，对于奶牛乳腺炎的发病机制以及主要的致病病原菌都有了更加深入、细致的认识和了解，同时在此基础上，在对各种病原菌进行分离与鉴定的基础上，针对多重PCR反应体系的建立与优化进行了分析，可以说为今后进一步做好乳腺炎的检测，提供了一定的依据和参考，为后期进一步做好综合性防控奠定了坚实、有力的基础。当然，如果想要降低乳腺炎的发生概率，尽快实现饲养管理的科学化、合理化以及规范化是至关重要的。

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