α疱疹病毒ICP4的转录调控机制

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疱疹病毒(Alphaherpesvirus)是一类具有相同形态学且具有囊膜的双链DNA病毒，已知有120多种，成熟的病毒粒子由核心(core)、衣壳(capsid)、皮层(tegument)和囊膜(envelope)4个部分组成[1]，按其理化性质可划分为α、β、γ 3个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广，可以感染人类和其他脊椎动物[2-4]。而α疱疹病毒感染后随着基因表达时序的不同，分为立即早期(IE)基因、早期(E)基因和晚期(L)基因，其中IE基因调控着E基因和L基因的表达。目前在1型人单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1，HSV-1)中已发现了5个IE基因，包括ICP0、ICP4、ICP22、ICP27和ICP47， 而ICP4编码的蛋白质为病毒基因表达和复制所必需，为最重要的IE基因，它不仅对病毒的E基因和L基因有转录激活的作用，同时，在某些特殊条件也下发挥着转录抑制的作用。

1 ICP4的结构特点

α疱疹病毒基因组由特定长区(UL)和特定短区(US)两个共价结合的片段组成，每一区域两侧都与反向重复序列相连，其中，UL和US之间的重复序列为内部重复序列(IR)，而整个基因组两端的重复序列为末端重复序列(TR)[5]。ICP4基因在病毒基因组的2个重复序列区域——IR和TR分别有一个拷贝，是α疱疹病毒中仅有的2个双拷贝基因之一。

在HSV-1中，ICP4表达产物是一个大小为175 kDa的蛋白，具有基因表达调控蛋白所具有的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)结构[6]并以二聚体的形式存在[7]。ICP4和许多其他的转录因子一样，拥有几个功能区域：DNA结合区域、核定位区域以及两个反式激活区域[8]，这些功能区域赋予了ICP4多种功能。Deluca[9-10]等通过构建ICP4不同区域缺失的突变体来探究ICP4的功能域，其中只表达N端251个氨基酸的突变体既没有激活功能也没有抑制作用，可见N端对调控转录的重要性；通过比较缺失ICP4不同区域的突变体在宿主细胞内的表达位置确定了ICP4核定位功能域为641-774位氨基酸。Shepard[11]等通过构建细胞系和基因缺失的方法证明，缺失31-274位氨基酸的ICP4可结合到DNA上但不能调控任何类型基因的转录；如果结合DNA的区域缺失，ICP4的调控能力也会受到极大的影响。

ICP4蛋白的N末端和C末端共同调控着基因的表达且N端对ICP4的功能影响更大，缺失N端50～100位氨基酸所产生的影响比缺失整个C端的500个氨基酸影响大[12]，而N端30～210位氨基酸影响ICP4与TFIID的相互作用[13]，该区域缺失后会影响RNA聚合酶II对转录因子的招募；N端还促进前起始复合物(Pre-Initiation Complex,PIC)的形成。C端在启动L基因启动子及L基因与转录因子形成转录复合物时发挥作用，故C端的缺失对L基因的表达有极大影响，但对E基因的表达影响较小[14]；此外，ICP4蛋白在病毒DNA上多聚化需要C端参与，增加ICP4对DNA的亲和力[15]。

2 ICP4的定位

病毒感染的早期，ICP4分散在细胞核的核质中；病毒感染的晚期，ICP4则分布在细胞核中的球状结构[16]。而Kalamvoki M等研究发现，缺失gE、gI或UL41的HSV突变株感染细胞后，胞质中也有ICP4的存在[17]；此外，ICP27也会影响到ICP4在细胞中的定位[18]。这说明，ICP4在细胞中的分布与其他蛋白有关。

ICP4是病毒粒子的组分之一，Suzanne M等通过比较HSV-1亲本株与ICP4缺失株病毒粒子的蛋白成分差异，发现亲本株病毒粒子中含有ICP4蛋白而缺失株病毒粒子中没有ICP4蛋白，证明了ICP4确实是病毒内部成分[19]。Everett的研究表明ICP4在病毒感染早期时还会结合在基因组上形成病毒核蛋白，以进入病毒的复制中心[20]。

3 ICP4转录激活作用

在宿主细胞RNA聚合酶II(RNA Polymerase II，RNA POL II)介导的疱疹病毒基因转录过程中，转录调控因子IID(Transcription factor II D,TFIID)含有能识别TATA框的TATA结合蛋白(TATA-binding protein，TBP)而对病毒基因的启动子进行识别[21]。Sampath等对HSV-1研究表明，只有在ICP4与tk和gC启动子结合后，TBP和RNA POLII才能结合到tk和gC基因的启动子上[14]，表明ICP4对于病毒E基因和L基因的启动子与其他转录因子形成转录复合物至关重要。RNA POLII介导的转录中需要TFIID和中介体(Mediator)的参与，在病毒感染期间，ICP4不仅与TFIID相互作用，还会与中介体相互作用[22]，中介体在影响RNA POLII转录机制上起着重要的作用，它通过促进RNA POL II加入PIC以建立上游激活剂和普通转录机制之间的桥梁，其中，PIC主要由一般转录因子(General transcription factors,GTFs)和RNA POL II构成，且PIC的形成是RNA POL II转录机制形成的先决条件[23]。Lauren M等在对ICP4与TFIID结合的研究中发现，ICP4会和TFIID中的一系列TBP连接因子(TBP-associated factors，TAFs)结合，这些结合的TAFs复合物在整个病毒感染过程中都会被检测到，而ICP4与中介体的结合只会在随后被检测到[24](图1A)。

A. ICP4在发挥激活功能时，会和RNA聚合酶II、中介体(Mediator)、TFIID和TAFs共同作用；B.ICP4在发挥抑制转录的功能时，与DNA上的特异性序列结合并与TBP和TFIIB形成TPC。而随着病毒感染过程的推进，由其他细胞转录因子所介导的转录将会因为E蛋白和L蛋白的增多而受到影响。图1 ICP4转录调控机制[28-29]Fig.1 Transcriptional regulation mechanism of ICP4[28-29]

ICP4蛋白激活E基因和L基因的机制是不同的，且涉及的转录因子也不一样。在HSV-1中，ICP4与TFIID、TFIIA等转录因子以及RNA POL II共同进行E基因转录的调控，其中，ICP4加强了TFIIA使TBP稳定结合TATA框的能力；而HSV-1的L基因具有启动子元件(initiator elements，INRs)，该元件的存在使L基因的转录调控并不需要TFIIA的参与，且ICP4能够代替TFIIA使TFIID稳定结合在L基因上[14，25-26]。

在调控转录过程中，ICP4在DNA上多聚化使其与DNA的亲和力增加，从而可与DNA更好地结合[15]，但它与被激活转录的基因启动子DNA不需要高度特异性的结合。Smiley等将缺失了gD基因启动子上游与转录起始位点下游的ICP4特异性结合位点的突变株感染细胞后发现，gD基因的转录几乎没有受到影响[27]。

4 ICP4的转录抑制功能

α疱疹病毒ICP4对自身、LAT(Latency Assciatited Transcript，LAT)及L/STs(L/S junction-spanning transcripts，L/STs)转录可产生抑制作用，在ICP4转录激活调控的过程中不需要与DNA上的特异性序列结合，但发挥转录产生抑制作用时，其与DNA上的特异性序列结合却是必不可少的条件，ICP4与DNA上的特异性序列结合时，亲和力极高，这段特异性序列为ATCGTCNNNNYCGRC(R代表嘌呤，Y代表嘧啶，N代表任意碱基)。此外，ICP4抑制自身基因启动子的转录和其与DNA的结合位点接近TATA框和转录起始位点有关，ICP4的抑制功能主要受制于ICP4-DNA结合位点与TATA框的距离[30]。虽然在E基因和L基因的启动子上也有和ICP4蛋白亲和力比较高的位点，但这些位点并不在转录起始位点，所以不会被抑制。

ICP4与TBP和TFIIB形成三元复合物(tripartite complex，TPC)并与调控基因的DNA结合而发挥转录抑制作用，不能形成TPC的ICP4突变体是不能进行转录抑制调控的[31-32]。ICP4除了抑制其本身、LAT与L/ST的转录外，其他IE基因也会随着ICP4蛋白表达的增加而被抑制转录，然而其他IE基因并没有ICP4抑制的结合位点，但具有其他细胞转录因子结合位点，比如SP1，它的激活能力会随着病毒感染的进程而减弱，从而影响其他IE基因的转录[33](图1B)。

5 ICP4与病毒潜伏感染

α疱疹病毒在入侵宿主细胞后，可在神经节细胞内形成潜伏性感染，逃避宿主巨噬细胞、自然杀伤细胞及干扰素杀伤作用的自然防御系统，在病毒潜伏的过程中没有完整的基因组复制，仅有小部分基因进行了转录。当宿主抵抗力下降之后，病毒在神经节和相邻的神经组织内复制。

LAT是HSV-1在潜伏期间唯一大量存在和转录的RNA，在潜伏感染的建立、维持及激活中扮演着重要的角色；同时，在HSV-1潜伏感染期间也能检测到ICP4的RNA[34]。LAT的启动子上具有ICP4高度特异性的结合位点，该位点对ICP4发挥转录调控作用至关重要，当ICP4与LAT的特异性结合位点结合后，可抑制LAT的转录；ICP4不仅可抑制LAT，还可抑制LAT所编码的靶向ICP0、ICP34.5的miRNAs[35]，其中ICP0在HSV-1由潜伏感染进入裂解性感染的过程中起到重要作用[36]，进一步证明ICP4对维持潜伏是必要的。此外，在HSV-1由潜伏状态进入激活状态时，ICP4会和HSV-1的其它miRNAs相互作用，如miR-H6会抑制ICP4蛋白的表达而影响HSV-1的潜伏[37-38]。最近，Maroui Ma的研究发现ICP4和ICP0对包含HSV-1 DNA的早幼粒细胞白血病(Promyelocytic leukemia，PML)核小体(Viral DNA-containing PML nuclear bodies，vDCP-NBs)的形成有重要作用，而vDCP-NBs与病毒基因组的潜伏感染时的主要表现形式相关[39]。

6 ICP4的其他功能

除了调控病毒基因转录和介导病毒潜伏感染外，ICP4还具有许多其他功能。例如，miR-101是Hela细胞编码的一种miRNA，可影响HSV-1的复制[40]，而ICP4会介导miR-101表达从而抑制HSV-1的复制[41]。此外，Dembowski JA的研究还发现，ICP4可能还会影响重要的染色质重塑细胞因子的招募[42]。

ICP4和细胞凋亡也有一定的关联，HSV-1诱导细胞凋亡的的功能可被病毒自身的某些蛋白抑制[43]。Leopardi研究表明，ICP4具有抗凋亡功能，是抑制HSV-1诱导凋亡的因素之一[44]；PirittaPeri也发现，ICP4和US3缺失的HSV-1感染U937细胞会出现大量凋亡和坏死性凋亡现象[45]。

ICP4还能对宿主细胞中的一些因子进行转录调控，血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)是导致感染HSV-1复发性角膜疾病的因素之一,ICP4可以调控VEGF-A的转录而促进新血管的广泛生成，从而导致复发性角膜疾病，其机制是VEGF-A启动子中含有和病毒E基因启动子中一样的顺式CG框，ICP4得以进行转录调控[46]。

HSV的ICP4对人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染后在CD4+淋巴细胞中的复制也会产生影响，Albrecht M A 将标记的HIV分别与HSV 亲本株、ICP0缺失株、ICP4缺失株和ICP27缺失株病毒共同感染CEM细胞，发现HIV和ICP4缺失病毒株共感染时，HIV不能复制，而和其他的毒株共感染时却可以复制，说明ICP4会增强HIV在人CD4+淋巴细胞中的复制[47]。

7 ICP4与其他蛋白互作

ICP4可以与许多其他病毒蛋白相互作用对彼此的表达及作用产生影响。Liu M等报道了ICP0和ICP4在病毒感染细胞中的直接相互作用，ICP4可以抑制ICP0的转录，而ICP0也要拮抗ICP4的抑制[48]。在缺失ICP0的情况下，敲低干扰素诱导蛋白(Nuclear Interferon (IFN)-Inducible Protein 16，IFI16)，ICP4的表达会增加[49]。ICP4和 ICP0还会协同诱导E基因和L基因的转录[50]。此外，UL21蛋白的累积会延迟ICP4蛋白的合成[51]；被膜蛋白UL7的突变也会减少ICP4的转录，进而减弱HSV-1的毒力[52]。ICP27对ICP4的抑制功能具有调节作用，在缺少ICP27的情况下，ICP4对L/ST启动子的抑制作用有所下降[53]；而在感染了ICP27突变株的细胞中，核内包含着ICP4蛋白的病毒复制结构无法形成，取而代之的是小指环状的结构[54]。

8 展 望

ICP4是α疱疹病毒中一个必需蛋白，在激活病毒E和L基因的转录、表达和调控病毒的潜伏感染等方面具有重要作用，目前对HSV-1 ICP4的研究较为深入且集中于功能域对转录调控产生的作用、与其他蛋白及宿主细胞因子之间的相互作用以及与DNA结合的模式等方面，而对α疱疹病毒亚科其他成员的ICP4的研究资料相对缺乏，今后应将研究重点放在ICP4对潜伏感染的调控及与细胞凋亡的关系等方面。

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