针刺对缺氧缺血性脑病新生小鼠脑组织细胞凋亡的影响

肖爱娇,欧阳昕,陈明人

缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生儿时期较为常见的疾病之一,是指各种围生期窒息引起的部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而导致胎儿或新生儿脑损伤[1]。新生儿HIE具有较高的致死率和致残率[2-3],对该病的研究已引起了广泛的关注。近年来临床研究报道显示,针刺治疗HIE及其后遗症日渐增多,并证实其有效性[4-5],然而有关针刺治疗急性期HIE的报道很少,其治疗急性期HIE的作用机理研究也并不多见。有研究表明,细胞凋亡参与了新生鼠缺氧缺血性脑损伤的发病过程[6-7],而caspase-3被认为与细胞凋亡关系最为密切,是细胞凋亡过程的主要执行者。

本课题组前期研究观察到,造模后3 d HIE新生小鼠脑组织中细胞凋亡数和caspase-3表达增加[8-11]。那么,针刺治疗能否通过降低脑组织中caspase-3表达、减少细胞凋亡而减轻急性期缺氧缺血性脑损伤?为此,本研究在前期研究的基础上,采用7 d 新生小鼠制备HIE模型,观察针刺治疗急性期缺氧缺血性脑损伤的效果及对脑组织细胞凋亡和caspase-3表达的影响,以探讨针刺的作用机理,为促进针刺在急性期HIE临床防治中的应用提供科学依据,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

选用7 d ICR新生小鼠129只,雌雄不限,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司(许可证号 SCXK湘2013-0004)。随机分为假手术组、模型组和针刺组。假手术组只行颈部正中切口手术,分离但并不闭合颈总动脉,不缺氧;模型组结扎并剪断左侧颈总动脉,然后给予缺氧处理;针刺组同模型组,于缺氧后进行针刺治疗,每日1次,每次20 min。各组由于术中出血、缺氧、母鼠咬死及病情进展等原因,死亡 47只,死亡率为36.4%。剩下的82只小鼠中,模型组34只,针刺组29只,假手术组19只。

1.2 主要试剂和仪器

TTC试剂(2,3,5-氯化三苯基四氮唑,Sigma);一抗,兔抗小鼠 caspase-3(#9664,Cell Signaling Techno- logy);二抗,山羊抗兔(A11011,Invitrogen);荧光封片剂(P36931,Invitrogen),含 DAPI(4'-6'diamino- 2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚);凋亡原位检测试剂盒(S7165,Millipore)。头戴式手术显微镜(DL-SSJ,中国 DL公司);荧光显微镜及图像分析软件(Leica 2000,Leica)。

1.3 HIE新生小鼠模型制备

参照文献[8-11]制备HIE新生鼠模型,动物在异氟烷吸入麻醉状态下行颈部正中切口,分离、闭合左侧颈总动脉,缝合伤口;术后动物在室温中恢复和母乳喂养 2 h后,进行缺氧处理,即将动物置于 37℃密闭舱,通入氮气(N2),调节氧气浓度为8%,100 min后取出。

1.4 针刺治疗方法

取督脉上大椎穴作为治疗穴位。大椎穴的定位参考《实验针灸学》[12]中鼠针灸腧穴定位方法,位于第7颈椎与第1胸椎棘突间,背部正中。在脑缺氧缺血后当日,采用苏州医疗用品厂有限公司出品的0.30 mm×13 mm无菌针灸针进行斜刺,留针20 min,每日1次。

1.5 观察指标

1.5.1 脑组织梗死检查

于造模后1 d,给予动物异氟醚吸入麻醉后迅速取脑,以 1.5 mm左右间隔自额向枕切成 4个冠状切片,加入1%TTC染液,置于37℃温箱中染色20 min,用扫描仪进行扫描,运用Image J软件(national institute of health, USA)测量每张脑片的梗死面积,并计算梗死面积百分比[8-11]。梗死面积(%)＝[健侧半球面积－(患侧半球面积－梗死面积)]/全脑面积×100%。

1.5.2 脑组织形态学观察

于造模后7 d,给予动物异氟醚吸入麻醉后迅速取脑,用数码相机拍照,然后切片(厚 30 μm),DAPI染色后封片,采用显微镜观察拍照。

1.5.3 脑组织细胞凋亡检测

采用TUNEL法检测脑组织细胞凋亡。于造模后3 d,给予动物异氟烷吸入麻醉后迅速取脑,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。细胞凋亡检测参见相关文献[8-11]进行操作。图中红色为TUNEL染色阳性细胞,用Image J软件进行图像分析,计数每个200倍视野下的TUNEL阳性细胞数。

1.5.4 脑组织caspase-3阳性细胞检测

采用荧光免疫组织化学法进行测定。于造模后3 d,给予动物异氟烷吸入麻醉后迅速取脑,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。脑组织caspase-3阳性细胞检测参照相关文献[8-11]进行操作。图中有caspase-3蛋白的部位呈现红色,用 Image J软件进行图像分析,计数每个200倍视野下的caspase-3阳性细胞数。

1.6 统计学方法

所有数据采用SPSS13.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,多组间采用方差分析,组间多重性比较采用Dunnett’s test。

2 结果

2.1 针刺对HIE模型小鼠脑梗死面积的影响

由图 1可见,假手术组小鼠可见脑组织全部染成红色,未见梗死灶;模型组小鼠可见右侧半球呈红色,左侧半球有白色梗死灶;针刺组小鼠可见右侧半球呈红色;左侧半球有白色梗死灶。经测量分析,模型组脑组织梗死面积百分率与假手术组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01);针刺组脑组织梗死面积百分率与模型组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01)。详见表1。

表1 各组脑组织梗死面积百分率比较 (x±s,%)

2.2 针刺对HIE模型小鼠脑组织形态的影响

由图2可见,假手术组(n=6)脑大体形态可见脑组织红润,脑沟及脑回清晰,左右两半球基本对称;模型组(n=7)可见左侧脑组织萎缩、塌陷;针刺组(n=9)可见左侧脑组织小面积梗死灶,脑沟变浅。

由图3可见,假手术组(n=6)DAPI染色结果可见脑组织细胞排列整齐、致密;模型组(n=7)可见患侧脑组织细胞排列紊乱、疏松,有大量细胞脱落,细胞间隙变大;针刺组(n=9)可见患侧脑组织排列较整齐、致密,有少量细胞脱落。

2.3 针刺对HIE模型小鼠脑组织细胞凋亡的影响

模型组小鼠左侧脑组织TUNEL阳性细胞数明显多于假手术组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);而针刺组小鼠左侧脑组织TUNEL阳性细胞数明显低于模型组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。详见表2、图4。

表2 各组脑组织TUNEL阳性细胞数比较 (x±s,个)

2.4 针刺对HIE模型小鼠脑组织caspase-3表达的影响

模型组小鼠左侧脑组织caspase-3阳性细胞数明显多于假手术组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);而针刺组小鼠左侧脑组织caspase-3阳性细胞数明显低于模型组,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。详见表3、图5。

表3 各组脑组织caspase-3阳性细胞数比较 (x±s,个)

图1 各组小鼠脑组织TTC染色结果

图2 各组小鼠脑大体形态

图3 各组小鼠脑组织DAPI染色结果(×50 μm)

图4 各组小鼠脑组织细胞凋亡结果(×50 μm)

图5 各组小鼠脑组织caspase-3表达结果(×20 μm)

3 讨论

新生儿缺氧缺血性脑病是指由围生期窒息引起的足月儿和近足月儿(胎龄≥34周)的缺氧缺血性脑损伤(HIBD)。HIE是导致新生儿死亡和不可逆性脑损伤的主要原因,重者可遗留脑性瘫痪、癫痫等难治性儿童脑病,轻者也可能是导致患者今后学习障碍、轻瘫、细微运动问题、注意力缺陷等危险性升高的原因。因而对该病的研究引起了广泛的关注。

针刺疗法作为中医学的独特分支,具有安全有效、无不良反应等优点,在成人脑梗死治疗中越来越受到人们的重视。大量的临床试验研究和动物实验研究表明,针刺对梗死脑组织具有多水平、多通道、多靶点的保护和干预作用。近年来临床研究报道显示,针刺治疗新生儿HIE及其后遗症日渐增多,并证实其有效性[4-5]。动物研究观察到针刺具有减轻新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的作用[13]。然而关于针刺治疗急性期新生小鼠HIE的报道并不多见。本研究采用7 d新生小鼠制备HIE模型,观察到造模 24 h内针刺大椎穴可缩小HIE模型小鼠脑梗死面积,减少脑组织细胞脱落,表明针刺具有减轻新生小鼠缺氧缺血性脑损伤的作用。然而其作用机理尚不十分清楚。

新生儿HIE的病理机制很多,涉及氧化应激、炎症反应、兴奋性毒性和细胞凋亡等。其中,细胞凋亡在缺血性脑损伤中的作用十分重要[6-7,14-15],且在未成熟脑中比成年脑中更常见[7]。细胞凋亡是 1972年由 Kerr和 Curry提出的,是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序由基因调控的主动性死亡过程,其发生、发展都受到精确的调控,具有独特的信号通路。目前研究表明,细胞凋亡通路主要有 caspase依赖性凋亡通路——内源性线粒体通路和外源性死亡受体通路以及非caspase依赖性凋亡通路。线粒体通路又称为内源性凋亡途径,由于线粒体被认为处于哺乳动物细胞凋亡调控的中心位置,因此对该通路的研究一直占有重要地位。线粒体凋亡通路的主要过程是,当细胞受损后,细胞色素 C(Cyt-C)从线粒体释放,与细胞凋亡激活因子1(Apaf-1)结合活化caspase-9前体,从而激活caspase-3,引发caspase级联反应,最终导致细胞凋亡的发生。死亡受体通路又称为外源性凋亡途径,该途径的信号转导通路主要包括Fas、TNFR1、DR4/DR5和 DR3,虽然这些通路的启动、传导与调控各不相同,但也并非完全独立,最后都通过各自渠道激活caspase引发细胞凋亡。非caspase依赖性通路,其机制是一个繁杂的过程,其中以多聚 ADP核糖聚合酶(PARP-1),凋亡诱导因子(AIF)介导的凋亡通路研究较多。PARP-1是一种DNA修复酶,在DNA片段化时被激活,参与DNA的复制、转录和修复。AIF是一种存在于线粒体膜间隙的黄素蛋白,当凋亡信号刺激时,AIF从线粒体释放到细胞浆,再通过核定位信号转移至细胞核,引起染色质浓缩和大片段DNA断裂[16],造成细胞凋亡。由于细胞凋亡过程中染色体DNA的断裂是一个渐进的分阶段的过程,染色体 DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50～300 kb的大片段,然后在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下,形成180～200 bp核小体DNA多聚体。因此,大量的DNA双链断裂被认为是凋亡最显著的特征。TUNEL法(即脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法)是将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶等形成的衍生物标记到DNA的3’-OH末端,从而进行凋亡细胞的检测。该检测方法灵敏度高、反应快,能检测出极少量的细胞凋亡,因而被广泛应用于细胞凋亡和神经元退化的检测,也被认为是检测细胞凋亡的金标准[17]。为此本研究采用 TUNEL法检测脑组织细胞凋亡,结果观察到HIE模型组小鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数明显增多;而与HIE模型组相比,针刺组小鼠脑组织TUNEL阳性细胞数明显减少(见图 4),表明脑缺氧缺血后发生了细胞凋亡,与文献[8-11]报道结果相近;而针刺具有抑制细胞凋亡的作用,这一结果与文献[13,18]报道基本一致。但是对于针刺通过哪条凋亡信号通路起作用还不清楚。

Caspase蛋白是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶,而 caspase-3是沟通内源性通路和外源性通路的交汇点,被认为与凋亡关系最为密切,在细胞凋亡中的作用也备受关注。有研究指出,caspase-3在细胞凋亡中起着重要的调控作用,是细胞凋亡过程中的主要执行者,它可水解多种蛋白底物,包括细胞骨架蛋白、细胞周期调节蛋白、细胞信号转导蛋白、DNA修复调节因子以及细胞存活等环节中重要的蛋白,导致细胞失去正常功能而凋亡[19]。由此推测,降低 caspase-3的表达或抑制caspase-3的活性可抑制细胞凋亡的发生。陈明明等[13]观察到朱琏针刺兴奋法通过降低caspase-3蛋白表达,从而减轻缺氧缺血性脑损伤。范春玲等[20]观察到头针透刺脑出血大鼠,可抑制脑部血肿周围的caspase-3的活化,从而使caspase-3参与诱导的细胞凋亡减轻,神经细胞得到保护。本研究结果显示,针刺大椎后小鼠脑组织中 caspase-3阳性细胞数明显减少(见图 5),这一结果与文献[13,20-21]报道基本一致,表明针刺可能抑制 caspase-3表达而抑制细胞凋亡。

综上所述,针刺减轻急性期缺氧缺血性脑损伤的作用,可能通过其抑制脑组织 caspase-3的表达及减少脑组织细胞凋亡实现的,这为促进针刺在防治急性期新生儿HIE的临床实践提供了科学依据。然而关于针刺究竟通过调控内源性信号通路还是外源性信号通路继而抑制细胞凋亡还有待于将来进一步的研究。

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