HPLC法测定阿达帕林凝胶中阿达帕林有关物质

朱雅莲 肖学成 崔开宇 王晓飘

[摘要]目的 建立测定阿达帕林凝胶中阿达帕林有关物质的高效液相色谱法。方法 采用色谱柱 ORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，以冰醋酸-水（0.1∶100）为流动相A，以乙腈-四氢呋喃（65∶35）为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为270 nm，柱温为30℃，进样量为100 μl，流速：1.2 ml/min。结果 阿达帕林与各杂质分离度良好，阿达帕林凝胶溶液在12 h内稳定，杂质A、B、C、D的定量限分别为0.38、0.56、3.75、1.5 ng；检测限分别为0.11、0.17、1.12、0.45 ng。阿达帕林在0.0225～0.1125 μg/ml 的浓度范围内峰面积与浓度呈良好的线性关系，回归方程为y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。结论 此方法测定阿达帕林凝胶中阿达帕林有关物质简单可行。

[关键词]阿达帕林凝胶；阿达帕林；高效液相色谱法；有关物质

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）3（c）-0020-05

[Abstract]Objective To establish the HPLC method for determination related substances of Adapalene in Adapalene Gel.Methods Chromatographic column ORBAX Eclipse XDB-C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） was used，and the mobile phase A was glacial acetic acid-water （0.1∶100），and the mobile phase B was acetonitrile-tetrahydrofuran （65∶35） to conduct the gradient elution.The wavelength of detection was 270 nm，the temperature of column was 30°C，the sampling amount was 100 μl，and the flow rate was 1.2 ml/min.Results Adapalene was well separated from various impurity.The solution of Adapalene Gel was stable in 12 hours.The limit of quantification of impurity A，B，C and D was 0.38 ng，0.56 ng，3.75 ng and 1.5 ng respectively，and the detection limit was 0.11 ng，0.17 ng，1.12 ng and 0.45 ng.Adapalene showed a good linear relationship between peak area and concentration in the concentration range of 0.0225-0.1125 g/ml，and the regression equation was y=9.9714x+0.003906 （r=0.9998）.Conclusion This method is simple and feasible to determine the related substances of Adapalene in Adapalene Gel.

[Key words]Adapalene Gel；Adapalene；HPLC；Related substances

痤疮是一种常发于颜面部的皮肤病，发病率高，青少年中常见，目前仍未找到有效的根治方法，临床上常用药物治疗，一般为局部给药和口服给药，由于口服治疗的药物均有不同程度的不良反应[1]，因此，临床上主要采用外治法进行治疗[2]。阿达帕林属于第三代维A酸类药物，对受体的选择性强，不良反应小，在较低的浓度下可达到治疗效果[3]，是外用维A酸类治疗痤疮的一线选择药物[4]。常见的剂型为凝胶剂。阿达帕林凝胶最先由法国高德美国际公司生产，商品名为达芙文。该药具有较强的抗炎作用，同时可以调节毛囊口角质，形成细胞的分化和增殖，此外还具有抑制皮脂分泌等作用[5]。临床上用于治疗寻常型痤疮，其治疗效果优于硫磺制剂、过氧苯甲酰凝胶，与他扎罗汀总疗效相似，不良反应较轻[6]。同时有研究表明，阿达帕林凝胶联合其他药物和方法不仅可以治疗轻中度痤疮[7-9]，对治疗跖疣、泛发性扁平疣和毛周角化症也有很好的疗效[10-13]。由于《中国药典》并未收载阿达帕林及制剂的质量标准，EP8.0版和USP38版也只有原料药的标准，因此，为了更好地保证药品质量，通过参考EP8.0版标准[14]和USP38版标准中阿达帕林原料药项下的有关物质检测方法及其他相关文献[15-17]，对阿达帕林凝胶中所含的有关物质进行检查和控制。

1 仪器与试剂

1.1仪器

UltiMate 3000 高效液相色谱仪（美国戴安）和相应的工作站；AUW220D电子分析天平（日本岛津）；CSH-1000GSD-1型综合药品稳定性试验箱（重庆创测科技有限公司）；ORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 药品与试剂

阿达帕林凝胶样品（由武汉诺安药业有限公司试制，批号为20170301、20170302、20170303，规格为0.1%）；空白辅料样品（自制，除不含阿达帕林外，其他成分均与样品一致）；市售阿达帕林凝胶（法国高德美国际公司，批号为5051139，商品名为达芙文）；阿达帕林对照品（欧洲药典委员会提供，批号为00DCL6，含量为99.9%）；阿达帕林杂质A（EP）对照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批号为C4X-18091-1607，含量为97.7%）；阿达帕林杂质B（EP）对照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批号为C4X-18092-1702，含量为98%）；阿达帕林杂质C（EP）对照品（欧洲藥典委员会提供，批号为0004OG，含量为100.0%）；阿达帕林杂质D（EP）对照品（Cato Research Chemicals Inc提供，批号为C4X-18093-1602，含量为98%）；乙腈、四氢呋喃为色谱纯，其他试剂均为分析纯；纯化水。

2 方法与结果

2.1色谱条件

采用ZORBAX SB-Phenyl柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：以冰醋酸-水（0.1∶100）为流动相A，以乙腈-四氢呋喃（65∶35）为流动相B；检测波长为270 nm；柱温为30℃；流速1.2 ml/min；进样量100 μl，梯度洗脱见表1。

2.2溶液的制备

2.2.1样品溶液 取阿达帕林凝胶约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5 ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，用2 ml乙腈-四氢呋喃-水（37∶20∶43）（下称稀释剂）清洗烧杯2次，合并清洗液至量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液备用。

2.2.2对照溶液 精密量取“2.2.1”溶液1 ml，置100 ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，再精密量取1 ml，置10 ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，备用。

2.2.3空白辅料溶液 取空白辅料样品0.625 g，精密称定，制备方法同“2.2.1”项下。

2.2.4系统适用性溶液 取阿达帕林和杂质A、B、C、D适量，加稀释剂稀释成含阿达帕林约为6.25 μg/ml和各杂质浓度为0.0375 μg/ml的混合溶液。

2.3专属性考察

2.3.1 辅料的干扰试验 取空白溶剂、空白辅料、原料药溶液、自制凝胶溶液各100 μl进样，记录色谱图（图1），结果显示空白溶剂、空白辅料对阿达帕林峰的检测无干扰。

2.3.2 杂质的定位与分离 取阿达帕林杂质A、B、C、D、主成分药阿达帕林溶液和系统适用性溶液分别进样，记录色谱图（图2），结果显示，四个已知杂质对主成分的检测并不干扰，且各杂质峰之间的分离度良好，证明此方法可有效分离阿达帕林与已知杂质。

2.4破坏性试验

制劑酸破坏 取阿达帕林凝胶约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的盐酸溶液l ml，摇匀，避光放置1 h后，用1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml中和，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

制剂碱破坏 取本品约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5 ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，加入1 mol/L的氢氧化钠溶液l ml，摇匀，避光放置2 h后，用1 mol/L盐酸溶液1 ml中和，再用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

制剂氧化破坏 取本品约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5 ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，加入30%的H2O2 1 ml，摇匀，避光放置23 h后，于80℃水浴中加热2 min，冷却至室温，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

制剂高温破坏 取本品约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5 ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，置100℃水浴中破坏2 h后，冷却至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。

制剂光照破坏 取本品约0.625 g，精密称定，置烧杯中，加四氢呋喃5 ml，超声使均匀分散，转移至10 ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，置4500Lx±500Lx的强光下照射0.5 h，摇匀，即得。

按上述色谱条件，分别取酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，记录色谱图，见图3～7，结果表明：①阿达帕林凝胶的酸、碱、光、热、氧化破坏溶液进样，所产生杂质峰与主峰均能基线分离，各降解产物峰之间、各降解产物峰与主峰之间的分离度均符合规定；②阿达帕林凝胶在氧化条件和碱性条件下比较稳定，在高温、光照和酸性条件下较为敏感。杂质含量的计算方法为面积归一法。

2.5精密度试验

取“2.2.4”项下的系统适用性溶液，在上述拟定的色谱条件下连续进样6针。试验结果表明，在该色谱条件下，主峰及各杂质峰的重复性好，阿达帕林与杂质A、B、C、D的峰面积分别为65.2543、0.5345、0.5345、0.0623、0.2180。RSD均<2.0%，满足试验要求。

2.6分离度试验

由于杂质C 的保留时间与主药阿达帕林的出峰时间最接近，因此主要考察阿达帕林峰与杂质C峰之间的分离度。取杂质C和阿达帕林适量加稀释剂制成每毫升含阿达帕林约为6.25 μg/ml和杂质C浓度约为0.0375 μg/ml的混合溶液，在上述拟定的色谱条件下连续进样6针。试验结果表明，杂质C峰与主峰分离度的平均值为11.07（>4.5），RSD=1.42%，分离度符合要求。

2.7样品溶液稳定性

取本品凝胶（批号20170301）按“2.2.1”项下的测定方法，新配制供试品溶液，在室温下放置0、2、4、6、8、12 h进样，记录色谱图，考察样品溶液稳定性。结果，凝胶中杂质D峰面积的RSD=1.18 %（n=6），单杂峰面积的RSD=0.52%（n=6），主峰峰面积的RSD=0.07%（n=6），总杂峰面积的RSD=0.12%（n=6），表明供试品溶液在室温条件下放置12 h稳定。

2.8定量限及检测限的考察

取杂质A、B、C、D对照品溶液，经稀释剂逐步稀释，分别进样进行测定，当信噪比（S/N）约为10左右时，杂质A、B、C、D的定量限分别为0.38、0.56、3.75、1.5 ng。当信噪比（S/N）≥3时，杂质A、B、C、D的检测限分别为0.11、0.17、1.12、0.45 ng。

2.9线性关系的考察

精密称取阿达帕林对照品适量，用稀释剂溶剂稀释，配成约为0.0225、0.03、0.0375、0.075、0.1125 μg/ml的线性系列标准溶液，按上述拟定的色谱条件分别进样，记录色谱图。以阿达帕林的浓度（C，μg/ml）为横坐标，对应的峰面积（A）为纵坐标，以最小二乘法进行线性回归方程计算及相关系数，方程式为y=9.9714x+0.003906（r=0.9998）。结果表明，在0.0225～0.1125 μg/ml的浓度范围内，阿达帕林峰面积与浓度之间呈良好的线性关系。

2.10样品测定

取批号为20170301、20170302、20170303三批样品及市售样品，按样品溶液的配制方法，经上述确定色谱条件检查，以主成分自身对照法计算杂质含量，结果见表4。

3 讨论

3.1流动相条件的选择

根据EP8.0版中阿达帕林原料药项下的有关物质检测方法测定的结果，其色谱条件对杂质A的检出有影响，考虑到辅料峰与杂质A峰保留时间的重合，将色谱条件进行调整， 增加第一步梯度的时间，将原换相时间由2.5 min增加至10 min；同时，增加水相（流动相A）的比例，将比例由50%增高至60%，减小有机相（流动相B）的比例，由50%降低至40%，以增加杂质A峰与辅料峰的分离度。但是，改变条件后，在30～40 min之间有明显的换相峰，这会影响其他杂质及主峰峰形，其原因可能是增加了第1步梯度的时间，并且缩短了第二步梯度换相时间，导致出现换相峰，因此，我们只增加了第一步梯度的时间，其他与EP8.0版有关物质检测方法保持一致。流动相条件具体见“2.1”，按此条件测定，阿达帕林和各杂质的分离效果较好。

3.2进样浓度的选择

由于各国药典并没有收载阿达帕林凝胶的检测方法，根据USP38版阿达帕林原料的有关物质的检测方法，供试品的浓度为2.0 mg/ml，考虑到阿达帕林凝胶的规格为0.1%，若采用同一浓度进行试验操作，即需取20 g凝胶置10 ml量瓶中，试验操作无法进行。根据凝胶溶解后过滤的可操作性，最终将供试品溶液浓度确定为0.0625 mg/ml。

3.3进样量的选择

根据上述溶液浓度的改变，为了满足系统适用性的试验要求，即系统适用性溶液中杂质C峰的信噪比应>10，将进样量由25 μl改变成100 μl。

4 小结

阿达帕林属于第三代维A酸类药物，对光较为敏感，结合相关的文献[18-19]和本文的破坏性试验，应于夜间使用，并且避光保存。

凝胶剂是近年来兴起的一种新型制剂，方便易制[20]，相较于乳膏使用时的油腻感，凝胶剂更易被患者所接受。但是，由于凝胶常用卡波姆等高分子聚合物，在制备样品溶液时会遇到过滤稍微困难的问题，目前还未找到合适的解决办法。

药物使用的不良反应与所含杂质的含量有密切的关系，因此有效控制杂质的含量对药物的使用安全有着至关重要的作用。目前对阿达帕林凝胶的有关物质检测方法并没有一个很好的检验标准。本文通过HPLC法对阿达帕林凝胶中有关物质进行了系统的方法学研究，为研究制定阿达帕林凝胶有关物质质量标准提供了依据。

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