异烟肼-柚皮素共晶的表征及其性能研究

梁文懂，罗 春，张海禄，张春桃

(1.武汉科技大学煤转化与新型炭材料湖北省重点实验室，湖北 武汉,430081; 2. 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，江苏 苏州,215123)

异烟肼(Isoniazid，INZ)是目前广泛用于各型肺结核治疗的首选药物[1]，水溶性好(183 mg/mL, pH=7.5)[2]，但在用药时会引起诸多不良反应，特别是生成大量亲电子基、氧自由基等活性代谢产物，耗竭肝内谷胱甘肽(GSH)，造成肝损伤[3]，严重时甚至导致必须停止用药[4]。柚皮素(Naringenin，NAR) 是一种黄酮类天然产物，能够抑制脂肪肝形成过程中自由基的产生，增强对Hep G2细胞氧化应激的缓解作用，减弱肝损伤[5]，并可使CCl4所致急性肝损伤过程中的氧化应激反应减轻,显著降低肝细胞核DNA单链断裂氧化损伤水平[6]，因而有望在降低肝损伤方面得到应用。但由于柚皮素的溶解度很低(46±6 μg/mL，298 K)，客观上导致其生物利用度相当低[7-8]。

近年来，药物共晶在改善药物的理化性质方面得到了广泛应用[9]。药物共晶可在不改变药物分子结构的同时，改善药物的理化性质，因而在药物研发中具有很高的应用价值。柚皮素的结构和性质均适宜与异烟肼形成共晶，有鉴于此，本文通过混悬法制备了异烟肼-柚皮素的药物-药物共晶，考察了柚皮素的多羟基结构与异烟肼上的吡啶氮和酰肼基团间的氢键作用，确定了共晶中异烟肼和柚皮素的比例，测定了原料以及共晶的表观平衡溶解度，分析了共晶产物中异烟肼和柚皮素平衡溶解度的变化对肝损伤以及对护肝作用的影响，以期为解决异烟肼所导致的肝损伤问题提供借鉴，并为异烟肼的共晶研究提供参考。

1 实验

1.1 试剂和仪器

异烟肼 (纯度不低于98%)；柚皮素(纯度不低于97%)；甲醇、乙醇、甲苯、乙腈(分析纯)。德国Bruker公司D8 ADVANCE粉末X射线衍射仪；美国TA Instruments公司Q2000差示扫描量热仪；美国Thermo Fisher傅里叶变换红外光谱仪；美国Varian公司Varian 400液态核磁共振仪；德国Bruker公司ADVANCEⅢ-500固态核磁共振仪；美国Wtaers2535高效液相色谱仪，PDA检测器；RC-6溶出度测试仪。

1.2 共晶的制备

分别称量137 mg异烟肼和272 mg柚皮素于20 mL冻干瓶中，加入5 mL甲醇/甲苯(体积比为1∶1)混合溶剂作为混旋液，在室温下磁力搅拌72 h后离心分离，除去上层清液，下层离心产物置于烘箱中，40 ℃烘干12 h即得共晶样品。

1.3 共晶的分析与表征

粉末X射线衍射(XRPD)：铜靶作为X射线源，工作电压40 V,电流40 A，粉末样品的扫描步长为0.02°，扫描角度范围为3°～40°，每步停留时间17s；差示扫描量热(DSC)：N2流速50.0 mL/min，加热速率5 ℃/min；傅里叶变换红外光谱(FTIR)：粉末样品用溴化钾压片后测试，扫描波数范围为400～4000 cm-1，扫描次数100，分辨率4 cm-1；固态核磁共振(SSNMR)：在11.7 T的场强下，用4 mm双共振魔角旋转探头采集固态下13C的交叉极化/魔角(CP/MAS)谱图，谱图采集条件：旋转速度为8 kHz MAS，接触时间为2 ms，13C化学位移参考值为四甲基硅烷(TMS,δ=0)；液态核磁共振(LNMR)：取5 mg左右样品溶解于氘代二甲基亚砜后进行扫谱，以四甲基硅烷(TMS，δ=0)为内标。

1.4 表观平衡溶解度测试

分别称量20 mg柚皮素、2000 mg异烟肼以及500 mg共晶样品，置于10 mL冻干瓶中，分别加入5 mL、 pH=1.2的盐酸溶液(模拟胃液)和pH=6.8的磷酸缓冲液(模拟肠液)。通过热台精确控温到37 ℃，并控制磁力搅拌转速为350 rpm，连续搅拌72 h后，抽取悬浊液，采用0.22 μm 的水系滤膜过滤并立刻用超纯水稀释。其中，柚皮素样品稀释5倍，异烟肼样品稀释1000倍，共晶样品稀释100倍。稀释液通过高效液相色谱检测其浓度。色谱条件为：固定相，C18反相柱(GraceSmart RP C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相，甲醇-水(体积比为1∶1)，流速为1 mL/min,柱温37 ℃。每个实验进行3次取平均值。未溶解的残渣通过滤纸过滤收集，经40 ℃烘箱干燥，通过粉末XRD确定其物相组成。

2 结果与分析

2.1 XRPD分析

原料异烟肼、柚皮素和共晶产物的XRPD图谱如图1所示。由图1可见，共晶的XRPD谱图在2θ为4.34°、8.60°、21.64°、26.70°等处出现新的特征峰，其中柚皮素在15.82°、17.28°、20.04°、22.46°、23.83°、24.57°、25.51°、27.82°等处的主峰都消失，异烟肼在11.92°、14.28°、15.61°、16.79°、25.26°、26.20°等处的主峰几乎全部消失，由此可见柚皮素和异烟肼之间确实形成了共晶。

图1 异烟肼、柚皮素和共晶的粉末XRD图谱

2.2 DSC分析

原料异烟肼、柚皮素和共晶产物的DSC谱图如图2所示。异烟肼和柚皮素的熔点分别为173.3 ℃和254.1 ℃，混悬产物的熔点为227.4 ℃，不同于任何一种原料，表明该产物为完全不同于原料的新相，这是典型的共晶形成的热力学标志。共晶的DSC只有一个特征熔融峰并没有原料的熔融峰，表明通过混悬制备的共晶样品晶相很纯。

图2 异烟肼、柚皮素和共晶的DSC图谱

2.3 FTIR分析

图3 异烟肼、柚皮素和共晶的FTIR图谱

2.4 SSNMR分析

通过密度泛函理论(DFT)计算，对两种原料和共晶的SSNMR图谱中碳峰进行了归属，结果如图4所示。由图4可以看出，共晶中的每个碳峰均为单峰，说明在一个不对称单元里Z′=1，表明共晶的摩尔计量比为1∶1。异烟肼原料中酰肼基C(11)的化学位移为166.62，在形成共晶后变为 169.18，吡啶氮两侧的C(14)、C(15)的化学位移则由149.19、151.42合并为共晶后的148.51；柚皮素在δ为166.86、165.31、153.41处的峰分别归属于C(5)、C(7)和C(4)的碳峰，在形成共晶后化学位移分别变为169.18、163.75、158.02。这些碳原子化学环境变化表明，异烟肼上的酰肼基和吡啶氮与柚皮素O(4)H、O(5)H、O(3)H三个羟基之间形成新的氢键作用，这与FTIR的结果一致。

图4 异烟肼、柚皮素和共晶的13C固态核磁共振图谱

Fig.4CP/MASTOSSNMRspectraofINZ,NARandcocrystal

2.5 LNMR分析

液态核磁共振氢谱是确定共晶分子间计量比最直观且有效的方法。异烟肼、柚皮素和共晶的LNMR氢谱如图5所示。图5中，RI表示氢峰的相对积分面积；NH表示异烟肼或柚皮素的各氢原子数目。由图5可见，共晶LNMR氢谱中的氢峰是两种原料氢峰的叠加，柚皮素与异烟肼的摩尔计量比为1∶1，与固态核磁共振所得出的结果相一致。

图5 异烟肼、柚皮素和共晶的液态核磁共振氢谱

2.6 表观平衡溶解度分析

异烟肼、柚皮素以及共晶在模拟生理液中的表观平衡溶解度如图6所示。由图6(a)可见，在pH=1.2的盐酸溶液和pH=6.8的磷酸缓冲液中，异烟肼的平衡溶解度分别为264 mg/mL和190 mg/mL，溶解度太大，容易在代谢过程中产生过量的亲电子基、氧自由基，人体没有足够谷胱甘肽(GSH)与之结合解毒，这正是其造成肝损伤的重要原因。异烟肼在与柚皮素形成共晶以后，在两种pH值条件下其溶解度分别减小到20.8 mg/mL和0.74mg/mL，分别降低为原来的7.9%和0.39%，意味着在同等给药条件下，异烟肼的肝损伤会大大减小。由图6(b)可见，柚皮素在与异烟肼形成共晶以后，在pH=1.2的介质中，其平衡溶解度从0.044 mg/mL提高到0.064 mg/mL；在pH=6.8的介质中，则由0.061 mg/mL提高到0.227mg/mL，分别提高到原来的1.45倍和3.72倍。柚皮素溶解度的提高意味着其清除自由基和亲电子基的能力的提高，从而提高护肝的功效。异烟肼、柚皮素和共晶溶解前后的粉末XRD图谱如图7所示。由图7可以看出，异烟肼和柚皮素在两种介质中达到溶解平衡后的残渣仍为原料异烟肼和柚皮素，没有发生相转化；图7(a)显示，共晶在pH=1.2介质中部分发生了裂解，残渣中既有共晶，也有柚皮素；图7(b)则表明，在pH为6.8的介质中，共晶没有发生裂解，残渣依然是共晶。

(a)异烟肼INZ

(b)柚皮素NAR

Fig.6ApparentequilibriumsolubilityofINZ,NARandcocrystal

(a)pH=1.2

(b)pH=6.8

Fig.7XRPDpatternsofINZ,NARandcocrystalbeforeandafterdissolutionexperiment

3 结论

(1)选用柚皮素作为共晶前驱体，以甲醇和甲苯的混合溶剂作为混旋悬液，可制备得到异烟肼-柚皮素的药物-药物共晶，共晶产物中异烟肼与柚皮素的摩尔比为1∶1，异烟肼的酰肼基团和吡啶氮与柚皮素上三个羟基形成了氢键。

(2)在pH值为1.2和6.8的两种模拟生理

液中，共晶产物中柚皮素相比纯柚皮素的平衡溶解度分别提升到原料的1.45倍和3.72倍，而共晶产物中异烟肼的平衡溶解度分别为纯异烟肼的7.9%和0.39%，表明在同等给药量的条件下，柚皮素的抗氧化、清除自由基、保肝护肝功效得到提高，同时异烟肼所致的肝损伤也会大幅减低，这种共同作用能够进一步强化保肝护肝的功效，药理作用明显。

参考文献

[1] 彭江丽，马国伟，喻明丽，等.洛伐他汀联合异烟肼、利福平、吡嗪酰胺致大鼠肝损伤的实验研究[J].安徽医药，2017，21(12):2157-2163.

[2] Aitipamula S,Wong A B H,Chow P S,et al. Novel solid forms of the anti-tuberculosis drug, isoniazid: ternary and polymorphic cocrystals[J].CrystEngComm,2013,15(29):5877-5887.

[3] 杜伟，杨亚男，赵 力，等.抗结核药物引起肝损害的药学监护[J].包头医学，2015，39(3):150-152.

[4] 陈飞.异烟肼对结核患者肝损伤的临床调查研究[J].中国民族民间医药，2013(24):75-76.

[5] 谢丽阳，张迪，吴薇,等.3 种黄酮对脂肪肝细胞氧化应激的影响[J].食品科学, 2011, 32(17):344-348.

[6] 李桃园,王昕，赵旋，等.柚皮素对四氯化碳致小鼠化学性肝损伤中氧化应激介质生成影响的实验研究[J].中国临床药理学杂志，2010，26(6):420-423.

[7] Kanaze F,Bounartzi M,Georgarakis M,et al. Pharmacokinetics of the citrus flavanone aglycones hesperetin and naringenin after single oral administration in human subjects[J]. European Journal of Clinical Nutrition,2007,61(4):472-477.

[8] Khan A W,Kotta S,Ansari S H,et al. Enhanced dissolution and bioavailability of grapefruit flavonoid naringenin by solid dispersion utilizing fourth generation carrier[J]. Drug Development and Industrial Pharmacy,2015,41(5):772-779.

[9] Qiao N,Li M,Schlindwein W,et al. Pharmaceutical cocrystals: an overview[J]. International Journal of Pharmaceutics,2011,419(1-2):1-11.

[10] Diniz L F,Souza M S,Carvalho P S,et al. Novel isoniazid cocrystals with aromatic carboxylic acids: crystal engineering, spectroscopy and thermochemical investigations[J]. Journal of Molecular Structure,2018,1153:58-68.