硫乙醇酸盐流体培养基（FT）改进效果的测试

2018-05-19李泽康卢勉飞蔡芷荷陈博吴清平万强

当代医学 2018年14期

李泽康，卢勉飞,，蔡芷荷，陈博，吴清平，万强

药品无菌检查法是一个定性检查，是用于检查《中国药典》要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法[1]。培养基是无菌检查的基础，其对微生物具有广谱的促生长能力和高度的检测敏感性。为此，各国药典无菌检查用培养基都处在一个不断改进的发展过程。

硫乙醇酸盐流体培养基（FT）是中国药典2015年版所规定药品无菌检查用的培养基之一，同时也是目前国际药典（美国药典、欧洲药典等）收载的药品无菌检查检测厌氧菌的特定培养基，同时此培养基也可用于需气菌的培养[2-7]。

由于商品化干燥培养基在生产过程中受原材料产地、质量、生产工艺等因素的影响，导致培养基质量的稳定性和检测性能随之发生改变，对检测结果的准确性可能产生直接的影响[3]。在我们的检验中发现，改进前的FT培养基在配制过程中，如果未完全煮溶就分装或分装时未摇匀，在灭菌后或14天的培养过程中会出现少量的混浊现象，混浊的培养液很容易引起结果的误判。这主要与配方中含有少量的琼脂粉有关，溶解于培养基质的琼脂透明度和分散均匀度欠佳。基于已有的研究经验，我们针对FT培养基存在的问题进行了改进，现将改进产品与国内产品比较的效果报道如下。

1 材料与方法

1.1 培养基改进前硫乙醇酸盐流体培养基（HK-1）；改良硫乙醇酸盐流体培养基（HK-2）；其他3个国内厂家I、II、III各购买了2批。胰酪胨大豆琼脂培养基和血琼脂由广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.2 培养基的制备分别将不同厂家的硫乙醇酸盐流体培养基按说明书要求制备成10 ml/管的液体培养基，灭菌后备用。

1.3 试验菌株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]和生抱梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]均购自卫生药部品生物制品检定所。

1.4 试验用菌悬液的制备将上述金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌菌株分别接种于胰酪胨大豆琼脂平板上，生孢梭菌菌株接种于血琼脂平板上，均置（36±1）℃培养18～24 h，以0.9%无菌生理盐水悬浮培养物，制备成约含活菌数10～100 CFU/ml的菌悬液，再以0.9%无菌生理盐水稀释成分别制成约含活菌数1～10 CFU/ml、0.1～1 CFU/ml和＜0.1 CFU/ml的菌悬液，备用；试验时以胰酪大豆胨琼脂培养基TSA分别计数金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌各剂量菌悬液的实际活菌数，以哥伦比亚琼脂平板计数生孢梭菌各剂量菌悬液的实际活菌数。

上述试验菌株的培养物均使用新鲜培养物，传代次数不超过5代。

1.5 实验方法

1.5.1 培养基感官和pH值测定培养基的配置均按说明书进行，分别制备成10 ml/管的液体培养基和用三角瓶分装500 ml，灭菌完毕后观察培养基，记录外观特征。同时在25℃恒温后用酸度计测定各培养基的pH值。

1.5.2 培养基的无菌试验及36℃恒温培养后的外观变化将已灭菌的500 ml三角瓶培养基置于恒温培养箱中（36±1）℃培养30 d，并逢第3、7、14天记录培养基的外观特征和是否有菌生长，包括培养基色泽外观、氧化层高度、是否有沉淀、是否有凝块等。

1.5.3 半定量法分别取上述不同剂量的试验菌株的菌悬液1 ml分别接种于受试的硫乙醇酸盐流体培养基管中，于（36±1）℃培养18～24 h后，轻轻振摇试管，同时与无生长管（阴性管）对照，当出现混浊时计为生长管（阳性管）。逐日观察结果，连续观察3 d，分别记录不同接种剂量的受试培养基每天新增的生长管数。每厂家受试培养基每稀释度分别接种5管，重复实验3次。

1.6 统计学方法数据分析采用SPSS 17.0软件General Linear Model检验。

2 结果

2.1 试验培养基的外观情况比较试验培养基的外观情况比较见表1所示，HK-1、HK-2以及厂家I、II、III和参照中检所的培养基均为淡黄色，也均无沉淀，但是在透明度方面有不同程度的差异，HK-2和厂家II的培养基透明清晰，而HK-1、厂家I和III以及中检所参照均不透明，有少许浑浊。

表1 试验培养基的外观情况Table 1 The appearance of the testmedium

2.2 试验培养基的pH值比较试验培养基的pH值比较见表2所示，根据中国药典2015版可知，硫乙醇酸盐流体培养基给出配方和pH值范围。从表2可见，所测定的HK-1、HK-2以及厂家I、厂家II和中检所的培养基均在标准的pH值范围内，只有厂家III的pH值稍低。

表2 试验培养基的pH值（25℃）Table 2 The pH of the testmedium(25℃)

2.3 试验培养基在无菌试验后的情况试验培养基在无菌试验后的变化情况见表3所示，6个受试的培养基在（36±1）℃培养14 d后均没有被杂菌污染，也没有凝块产生或者凝固。在培养基透明度方面，HK-2和厂家II的培养基在14 d之前均能保持较高的透明度。然而，HK-1、厂家I、厂家III和中检所的培养基透明度均比HK-2、厂家II的差，在14 d观察期内均不透明清澈，有少许浑浊。在氧化层高度方面，HK-1、HK-2、厂家Ⅰ、厂家Ⅱ、和中检所的培养基在14 d内均能保持为培养基深度的1/5；然而，厂家III的氧化层在7 d之后已占满整瓶培养基。

2.4 试验培养基的菌落形态比较试验培养基的菌落形态结果如表4所示，金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的菌落在HK-2和厂家II中均为颗粒状生长，而金黄色葡萄球菌在HK-1、厂家I、III和参照中检所中均为长条型生长，生孢梭菌在HK-1、厂家I、III和参照中检所中均为梭型生长。铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在各个厂家中均为培养基表层混浊生长。

表3 试验培养基在无菌试验后的变化情况Table 3 Change of the tested medium aftersteriling test

表4 各试验菌株在受试培养基上的生长比较Table 4 Comparison of the growth of each teststrain on the tested medium

2.5 试验培养基的灵敏度比较试验培养基的灵敏度结果如表5所示，当试验菌株的接种剂量为10～100 CFU/管和1～10 CFU/管时，各试验菌株在各受试培养基上的生长管数完全一致，差异无统计学意义；当试验菌株的接种量为0.1～1 CFU/管时，所有试验菌株在受试培养基中的生长管数比较均差异无统计学意义。

3 讨论

药品的无菌检查是以活的微生物为检测对象[7]，培养基的质量与稳定性对检测结果准确性的影响至为重要。本文选择药品无菌检查中检测厌氧菌的硫乙醇酸盐流体培养基流体作为受试培养基，而选用的4株试验菌株均为课题合作组规定和提供的试验菌株[8]，也是中国药典中用于无菌检查培养基性能测试的试验菌株[9]。

培养基的理化指标，包括外观色泽、澄清度、pH值等，均是培养基性能的检测项目之一。本文对改进前后的及其他3个国内厂家的受试培养基进行了相关指标的检测。在这5者的pH值测定中，只有厂家III的pH值低于标准范围，其他3个厂家无明显差异。然而，在透明度方面，4个厂家之间有差异，其中HK-2和厂家Ⅱ均为澄清透明无沉淀，而HK-1、厂家I、III和参照中检所均为不透明，有少量浑浊。这些差异可能与厂家使用的琼脂粉质量不同有关。本培养基需要少量琼脂（0.075%）[4]来降低培养基的内部对流，即可以防止二氧化碳、氧气和还原产物的扩散，有利于厌氧环境的形成[3]。然而，由于含有琼脂，在培养基经灭菌冷却后便会形成一些不均匀分布的絮状悬浮物，形成少许浑浊，培养基的透明度便会受影响。培养基透明程度高低会直接影响无菌检查中菌落存在与否的判定以及菌落生长形态的观察，培养基透明度越高应越有利于菌落生长的观察与判断。

培养基的细菌学质控（或称“细菌生长试验”）是培养基质量的性能试验，是培养基的内在质量指标。它是用已知的标准菌株按照规定的要求，测定培养基质量是否符合微生物的生长和营养需要，以便掌握培养基的灵敏度和准确度[10]。在菌落生长形态方面，金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的菌落在HK-2和厂家II中均为颗粒状生长，而金黄色葡萄球菌在HK-1、厂家I、III和参照中检所中均为长条型生长，生孢梭菌在HK-1、厂家I、III和参照中检所中均为梭型生长。铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌在各个厂家中均为培养基表层混浊生长。这表明某些菌株在低透明度培养基（HK-1、厂家I、III）比在高透明度培养基（HK-2、厂家II）的更加扩散性生长，这与参照中检所的结果相近。

培养基的灵敏度测试，是评价培养基性能的一个重要指标[11]。在灵敏度实验方面，在4株试验菌株中，4个厂家的受试培养基在接种剂量为10～100 CFU/管或者0.1～1 CFU/管时均无显著性差异，表明尽管不同厂家之间外观或者透明度方面有差异，但是其生长能力和灵敏度差异无统计学意义，这两方面结果提示了尽管培养基的透明度有所不同，某些菌株的生长形态有所区别，但是高透明度的培养基（HK-2、厂家II）其菌株的生长能力和灵敏度水平也高，这两方面均与参照中检所以及HK-1、厂家I、III相当。

综上所述，本文所选择的4个国内厂家的硫乙醇酸盐流体培养基对厌氧菌和需氧菌的检测效果有差异。HK-2和厂家II的培养基透明度比HK-1、厂家I、III更高，但是菌落的生长形态与这三者有差异。培养基透明度高低会影响菌株的生长形态，但不影响菌株的生长能力和灵敏度水平，同时透明度高低会直接影响实验结果的观察与判断，在高透明度的情况下应更有利于观察菌落生长。因此，在无菌检查中，使用该培养基时应考虑到上述因素。