23株非结核分枝杆菌药物敏感性试验分析

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非结核分枝杆菌(non—tuberculous mycobacterum，NTM)是指结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌，目前已知的有150余种，为条件致病菌[1-2]。其中鸟-胞内分枝杆菌复合菌组(Mycobacterium avium—intracellulare complex，MAC)、龟分枝杆菌、马赛分枝杆菌和偶发分枝杆菌等是主要常见致病菌[3]。NTM引起的疾病，可累及肺、淋巴结、皮肤、软组织等器官组织，以肺部多见[2]。NTM病快速增长，已经成为危害人类健康的公共卫生问题[4]。非结核分枝杆菌病和结核病由于在临床症状体征影像学资料、痰菌、病理活检等方面都十分相似，在按照结核病规范疗程治疗后效果欠佳时，医生往往考虑是否出现了广泛耐药结核或耐多药结核从而可能延误了病情。近些年来，随着细菌分离技术的不断提高和普及，免疫受损宿主感染菌群的变迁等原因，导致NTM感染和相关疾病的发生呈现上升趋势。

NTM对抗结核药物具有极高的耐药性，其对异烟肼、对氨基水杨酸钠、乙胺丁醇、利福平、链霉素等常用抗结核药物存在不同程度的耐药，耐药率高达97.46%，且大多菌株同时对多种抗结核药物耐药。NTM对大多数抗结核药物天然耐药的生理基础可能是NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁的通透屏障[3,5-6]。本实验采用《分枝杆菌、诺卡菌和其他需氧放线菌的药物敏感性试验》第二版推荐方法微孔板阿尔玛蓝测定法。该方法使用调过阳离子含5%OADC的MH肉汤(CAMHB)培养基，同时使用阿尔玛蓝指示剂，大大的提高了检测的灵敏性，缩短了药敏时间。采用该方法对从来源于临床肺结核患者中分离的非结核分枝杆菌进行药物敏感试验，讨论自贡市非结核分枝杆菌耐药情况。

1 材料与方法

1.1材料 收集自贡市2012年至2015年培养阳性的临床菌株，并且经hsp65、rpoB、ITS基因测序鉴定为非结核分枝杆菌的20株菌株。其中包括6株脓肿分枝杆菌、6株堪萨斯分枝杆菌、5株胞内分枝杆菌和3株鸟分枝杆菌。实验中使用到的26种抗生素均购自美国Sigma公司，阿尔玛蓝购自美国伯乐公司，OADC增菌液购自美国Bection Dickinson公司。标准菌株95021由中国疾病预防控制中心传染病预防控制中心结核病参比实验室提供。

1.2方法 药敏试验采用微孔板阿尔玛蓝测定法(microplate Alamarue assay，MABA)，检测对每种抗生素的MIC值[7-9]。26种抗生素分别为：氧氟沙星、利福平、异烟肼、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、环丝氨酸、对氨基水杨酸、乙胺丁醇、链霉素、妥布霉素、利福喷丁、利福布丁、环丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、力克肺疾、氯法齐明、头西、美罗培南、克拉霉素、米诺环素、复方新诺明、磺胺甲恶唑。抗生素按照美国临床实验室标准化研究(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的标准溶解(见表1)，液体培养基为含5% OADC的用调过阳离子的MH肉汤(CAMHB)培养基[9]。

刮取罗氏培养基上处于生长对数期的菌株，与生理盐水配成0.5个麦氏浓度，取50 μL加入到10 mL含5% OADC的 CAMHB中，以制备最终接种液(菌体浓度约为5×105CFU/mL)，颠倒混匀。96孔板第一行加入无菌盐水作为对照，第二排加入无药物的培养基作对照。药物浓度以2倍稀释方式由高至低递减。取稀释好的菌液100 μL加入到每孔培养基中，37 ℃恒温培养。试验设立阴性对照和标准菌株对照。24 h后在第一孔无药培养基中加入70 μL指示剂(20 μL阿尔玛蓝色和50 μL无菌5%吐温- 80)，育24 h后如果培养基变为红色，则在所有含药培养基中加入指示剂，24 h后观察结果；如果未变成红色，则继续在第二空中加入指示剂，培养24 h观察结果，如果没有变成红色则重复此步骤，如果变为红色则在所有含药培养基中均加入指示剂，24 h后观察结果。变色孔最低浓度与不变色孔最高浓度所对应的药物浓度范围为MIC值。将MIC值与药物的判读参考值(表1)进行比较，判断该菌株对该种药物是否耐药[9-11]。

2 结 果

23株非结核分枝杆菌的药敏结果均在1周内获得MIC值，与药物的判读参考相比，获得不同菌株对药物的耐药结果(表2)。其中23株非结核分枝杆菌对环丝氨酸、对氨基水杨酸、头西、美罗培南、磺胺甲恶唑、异烟肼、卷曲霉素耐药率为100%；对乙胺丁醇、力克肺疾、链霉素耐药率为80%～95%；对氧氟沙星、利福平、耐药率为70%；对利福喷丁、利福布丁、环丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、米诺环素、复方新诺明耐药率为30%～55%；其余药物低于25%。

比较药敏结果发现不同种属间对药物的耐药情况存在着种间差异。在26种药物中，脓肿分枝杆菌对其中22种药物耐药、胞内分枝杆菌和鸟分枝杆菌对其中的14种药物耐药、堪萨斯分枝杆菌对其中10种药物耐药。主要差异为氧氟沙星、利福平、米诺环素、复方新诺明为脓肿分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌耐药及堪萨斯分枝杆菌敏感；莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、利福喷丁、利福布丁、环丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星为脓肿分枝杆菌耐药，鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌敏感。

表1 抗生素浓度范围及判断标准

Tab.1 Concentration range of antibiotics and the judgment standard

抗生素浓度范围(μg/mL)标准菌株95021(μg/mL)最低抑菌浓度MIC(μg/mL)敏感(S)临界值(I)耐药(R)氧氟沙星64～0.03116～32--2利福平256～0.125>2565异烟肼256～0.125>256--1阿米卡星16～0.0084～8163264卷曲霉素16～0.008>16--2.5莫西沙星16～0.0084～8124加替沙星16～0.0082～4---左氧氟沙星16～0.008>16248环丝氨酸128～0.063128--50对氨基水杨酸64～0.031>64--2乙胺丁醇128～0.06332～645-10链霉素128～0.06364～1285-10妥布霉素64～0.0311～2248利福喷汀32～0.016>32---利福布丁32～0.01616～32--2环丙沙星32～0.0164～8124利奈唑胺64～0.03116～3281632司帕沙星16～0.0088～16---力克肺疾64～0.031>64---氯法齐明16～0.0080.25～0.5---头西64～0.03132～641632～64128美罗培南64～0.031>6448～1632克拉霉素32～0.0160.25～0.5248米诺环素32～0.016>3212～416复方新诺明256～0.125>25638-76磺胺甲恶唑256～0.125>256---

表2 23株非结核分枝杆菌药敏结果

Tab.2 Drug sensitivity test result of 23 strains of Mycobacterium tuberculosis

抗生素脓肿分枝杆菌(9株)鸟分枝杆菌(3株)胞内分枝杆菌(5株)堪萨斯分枝杆菌(6株)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)氧氟沙星90305006利福平90305006异烟肼90305060阿米卡星18031424卷曲霉素90305060莫西沙星90030506表2(续)抗生素脓肿分枝杆菌(9株)鸟分枝杆菌(3株)胞内分枝杆菌(5株)堪萨斯分枝杆菌(6株)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)耐药(R)敏感(S)加替沙星63030506左氧氟沙星90030506环丝氨酸90305060对氨基水杨酸90305060乙胺丁醇90304142链霉素90304160妥布霉素18030506利福喷汀90030515利福布丁90030506环丙沙星90120506利奈唑胺90032306司帕沙星90030506力克肺疾90305042氯法齐明18030506头西90305060美罗培南90305060克拉霉素18120506米诺环素81213206复方新诺明90214106磺胺甲恶唑90305060

3 讨 论

非结核分枝杆菌广泛存在于自然界的土壤，尘埃、水、鱼类和家禽中。传播途径主要从环境中获得感染，如污水等，而人与人之间的传染极少见。最近几次流调结果显示非结核分枝杆菌肺病正呈逐年的增长趋势。由于我国大部分地市级结核病实验室并未开展非结核分枝杆菌菌种鉴定工作，因此常将非结核分枝杆菌病误诊为结核病进行诊治，极大的延误了非结核分枝杆菌的临床治疗。由于比例法药敏试验步骤繁琐且耗时，不能及时获得菌株的耐药结果。本试验采用微孔板阿尔玛蓝测定法，共测定26种药物的MIC值，对于非结核的临床治疗药物选择提供了更多的依据。

从本实验的结果来看，非结核分枝杆菌对大部分结核类抗生素都耐药，尤其对常用的抗结核药物中的异烟肼、卷曲霉素、链霉素到达100%的耐药率；对氧氟沙星、乙胺丁醇、利福平达到70%以上耐药率。如果以结核分枝杆菌常规治疗方法则对患者无明显效果。实验结果显示自贡市非结核分枝杆菌对阿米卡星、妥布霉素、氯法齐明及克拉霉素基本敏感，与盛青等研究结果较为一致[12]。本实验共收集4种非结核分枝杆菌，其不同种对抗生素耐药程度也不相同，其中脓肿分枝杆菌耐药率达82.3%，鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌达53%，堪萨斯分枝杆菌耐药率最低为38%。每种分枝杆菌中的几株非结核分枝杆菌对抗生素的耐药情况基本一致，对不同药物的耐药与否，是不是该种的特性值得研究。当然本次试验中由于菌种较少，后期将继续收集菌株研究药物的耐药性与菌种的关系。

本实验中采用微孔板阿尔玛蓝测定法测定非结核分枝杆菌的MIC值，该方法中采用液体培养基及使用阿尔玛蓝指示剂，因此药敏时间大大的缩短。同时本实验检测了26种药物的MIC值，对于临床的治疗指导具有重要的作用。由于非结核分枝杆菌与结核分枝杆菌在临床的表现及实验室痰检结果极为一致，因此很难区分。对于非结核分枝杆菌肺病病原体应该尽早鉴定并及时进行药物敏感试验，才能对临床治疗提供重要的实验室依据。

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