IL-33敲除促进弓形虫感染小鼠腹腔巨噬细胞的M1偏移

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弓形虫是一种专性的细胞内寄生原虫，可以感染几乎所有的温血动物，呈全球性分布。弓形虫感染可导致人和其它哺乳动物流产，是人先天致畸的重要病原体，也是引起免疫缺陷疾病如AIDS和长期使用免疫抑制剂病人死亡的重要原因[1-2]。

白介素-33(interleukin-33, IL-33)是2005年作为磺基转移酶同源体(homolog of sulfotransferase, ST2)的配体被发现的一个新的IL-1家族成员。ST2选择性地在Th2细胞上表达，Th1则不表达，IL-33与ST2结合，通过下游信号分子髓样分化因子88(MyD88)，IL-1相关蛋白激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关因子 6(TRAF6)，使NF-κB 和MAPK活化，从而调节基因的转录，促进Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的产生及发挥后续的生物学功能[3]，故IL-33可增强Th2免疫反应。同时，IL-33也是Th2细胞的趋化因子，促使Th2细胞在淋巴结和组织中募集，通过促进Th2免疫反应、趋化嗜酸粒细胞、改变Mφ 的极化趋势，在多种炎症性疾病中发挥作用，如感染性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病等[3-6]。

巨噬细胞(macrophage, Mφ)是一种多分化来源的细胞，具有复杂的异质性与功能的多样性，在不同的微环境及不同的因子作用下可被激活成不同的表型，根据极化后细胞表面标志性分子及功能的不同，Mφ大体可分为经典激活的Mφ(Ml型)和替代激活的Mφ(M2型)。M1型细胞以CD68+、CD86+、MHCⅡ+为表型特征，表达诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，IL-12及膜蛋白CD16/32；通过产生iNOS分解L-精氨酸产生NO及反应性氧中间物(ROI)，促进炎症反应以及清除入侵微生物；高效递呈抗原、高水平合成促炎细胞因子，是激活Thl细胞反应的效应细胞，具有抗病原微生物和肿瘤细胞的作用[7-9]。而M2型细胞则通过表达I型精氨酸酶(Arginase1，Arg1)分解L-精氨酸产生L-鸟氨酸，L-鸟氨酸是脯氨酸前体，能促进胶原合成，促进损伤部位的修复；低表达IL-12，高表达IL-10、Arg1、甘露糖受体(CD206)、YM-1(几丁质酶家族成员)等；抗原递呈功能弱，通过抑制Thl免疫反应，诱导Th2细胞，抑制急性炎症反应、参与慢性炎症、肿瘤转移、超敏反应、创伤愈合等的发生和发展、促进损伤组织修复、重构和血管生长功能。iNOs和Arg1两者竞争性地结合L-精氨酸，并通过代谢产物发挥促炎或抗炎的相反作用[10-14]。

近期的研究表明，IL-33可促进Mφ 向M2方向极化，在Mφ 的极化中发挥重要作用。在IL-33诱导的气道炎症中，IL-33促进静止状态的肺泡巨噬细胞(AMs)向M2方向极化，表达CD206，IL-4Rα，产生高水平的CCL24和CCL17，去除AMs会减轻气道炎症反应。体外实验也显示，IL-13/IL-4Rα 信号通路在IL-33驱使AMs向M2a方向极化中起关键作用，IL-33放大了IL-13诱导的肺泡及骨髓来源的Mφ 向M2a方向极化，增加Arg-1，YM-1及CCL24和CCL17的表达。在先天性及抗原诱导性的气道反应性炎症中，IL-33/ST2在AMs向M2a极化中起重要作用[13]。Yang Z等的研究也证实IL-33诱导AMs主要是通过AAM自分泌IL-13激活IL-4Rα-STAT6途径，Mφ 作为IL-25/IL-33的效应细胞在Th2型免疫反应中起重要作用。去除小鼠Mφ 会减弱IL-25/IL-33诱导的2型免疫反应[15]。Besnard A-G等在研究小鼠实验性脑型疟疾(ECM)时也证实：IL-33通过促进Th2型的先天性淋巴细胞(ILC2)产生2型的细胞因子，如IL-4，IL-5，IL-13，从而驱使Mφ 向M2型极化，而M2型细胞再影响Tregs，最终抑制Th1免疫反应，减少IFN-γ，IL-12 和TNF-α 的分泌，抑制ECM的进一步发展[16]。最新研究也显示IL-33在柯萨奇病毒引起的心肌炎[5]和三硝基苯磺酸诱导的肠炎[6]中通过诱导Mφ 向M2方向极化从而减轻炎症发展。

综上所述，可见IL-33在Mφ 的极化中起重要作用，关于其在弓形虫感染Mφ 中的免疫作用还未见报道。因此本课题通过观察IL-33-/-小鼠PMφ 弓形虫感染后的极化趋势，进一步探讨IL-33在弓形虫感染免疫应答中的作用。

1 材料与方法

1.1虫株 ZS株刚地弓形虫(人源),基因型为ToxoDB#9 (Chinese 1)，由本室传代保种。

1.2实验动物 SPF级雌性C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠各48只，鼠龄12～14周，体重22～25 g，昆明鼠30只。C57BL/6 WT小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号码：SCXK(沪)2012-0002，合格证编号：20150 00509916，2015000518671]，C57BL/6 IL-33-/-小鼠由福建中医药大学林炜教授提供，和昆明鼠小鼠一起饲养于福建医科大学实验动物中心(实验动物使用许可证号：SYXK(闽)2012-0001，适用范围：SPF 级鼠类),动物房SPF层流柜中，鼠笼、鼠料、垫料、饮水经过高压消毒灭菌，每周垫料更换两次，动物使用协议由动物审查委员会批准。

1.3试剂及仪器 吉姆萨染液(北京中杉金桥生物有限公司)；引物(上海生工)；PerCP-Cy5.5 anti-mouse CD80，PE anti-Mouse TLR4，PE-anti-Mouse MHCⅡ，FITC-anti-mouse CD14，FITC-anti-mouse TLR2，Rat IgG2b，κIsotype Ctrl PE/ Rat IgG2a，κIsotype Ctrl APC(美国eBiosciences)；APC anti-mouse CD206，Rat IgG2b，κIsotype Ctrl PE，APC anti-mouse CD86(美国Biolegend)；RPMI 1640 培养液(美国Hyclone)；胎牛血清(美国Gibco)；Mouse IL-10，IL-12，TNF-α ELISA kit (杭州联科生物)；Griess Reagent System (美国Promega)；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美国 Fermentas)；SYBR Green Master(美国Roche)；温度梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；台式高速冷冻离心机Neofuge 15R(香港Heal Force Development Ltd)；酶标仪Multiscan FC、CO2培养箱Thermo Forma 3111型(美国Thermo Fisher)；Mx3005p实时荧光定量PCR仪ND2000C(美国StrataGene)；流式细胞仪(美国BD公司)；超净台(苏州苏净安泰)；超低温冰箱(英国NBS)。

1.4 方法

1.4.1小鼠基因型鉴定 采用Keisuke Oboki[17]设计的引物，由上海生物工程公司合成(表1)，提取小鼠鼠尾 DNA，PCR鉴定小鼠基因型。

1.4.2小鼠pMφ弓形虫感染率测定 参照文献[18]收集12～14周左右的 C57BL/6 WT 及 IL-33-/-小鼠 pMφ，每组6只，调整细胞浓度至1×106个/mL，以0.5 mL/孔接种于放了爬片的24孔细胞培养板中，放入37 ℃，5% CO2培养箱培养2 h，去除未贴壁的细胞，加入新鲜的0.5 mL 培养液继续培养24 h；加入0.5 mL 培养液稀释的2.5×106个/mL弓形虫速殖子(液氮复苏后传3代以上)，轻轻混匀后，继续培养30 min；弃培养上清液，加入 PBS 洗涤1次，冷风吹干，加入0.5 mL 的甲醇固定3 min，吸弃残余的甲醇溶液，加入姬姆萨染液0.5 mL 染色30 min，用蒸馏水洗涤2次，吹干爬片，用中性树脂固定于载玻片上，高倍镜下观察，计数200个细胞的感染率。

表1 C57B/L WT及IL-33-/-小鼠基因型鉴定引物

Tab.1 Primer sequences for genotyping

片段引物长度/bpWTex2-F:5'-CACTAAGACTACTCAGC-CTCAG489WT-R:5'-CGGTGATGATGCTGTG-AAGTCTGIL-33-/-ex2-F:5'-CACTAAGACTACTCAGC-CTCAG834KO-R:5'-GTGTTCTGCTGGTAGT-GGTCG

1.4.3实验分组及细胞培养和弓形虫感染方法 实验分4组，分别为 IL-33-/-小鼠 pMφ 弓形虫感染组和未感染组，WT 小鼠 pMφ 弓形虫感染组和未感染组。收集 WT 和IL-33-/-小鼠 pMφ，每组各6只，按5×105细胞/孔，复孔接种到24孔细胞培养板，置37 ℃，5% CO2培养箱培养2 h；洗去未贴壁细胞，加入0.5 mL新鲜的培养液继续培养24 h；取复孔中的一孔为感染孔，加入弓形虫速殖子1.2×105个/mL，0.5 mL/孔；另一孔为未感染孔加入0.5 mL 培养液，继续培养24 h；吸取培养上清液离心分装冻存于-70 ℃用于NO、TNF-α、IL-10、IL-12 的检测；收集细胞进行 Real-time PCR 和流式检测。

1.4.4Real-time PCR检测弓形虫感染前后pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA的表达 取感染24 h后收集的各组细胞，经Trizol 裂解、提取RNA、OD260/280测定其浓度和纯度；按逆转录试剂盒逆转录为 cDNA，采用20 μL 反应体系；按FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)说明书进行Real-time PCR 扩增，以β-actin作为内参检测 iNOS、Arg-1、IL-1、IL-4、IL-10、IL-12 mRNA相对表达量，引物见表2；PCR扩增条件为50 ℃ 2 min→95 ℃ 预变性10 min→(95 ℃变性15 s，60℃退火1 min→40个循环体系)→95 ℃ 15 s →60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s。反应结束后，用△Ct法进行计算：△Ct=Ct目的基因-Ct参照基因，△△Ct= (Ct目的基因-Ct参照基因)实验组-(Ct目的基因-Ct参照基因)对照组，2-△△Ct的意义即实验组目的基因相对于对照组目的基因表达量变化倍数，野生型小鼠未感染组为对照组。

表2 Real-time PCR 引物表

Tab.2 Primer sequences for real-time PCR

片段正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')IL-1βGGAAGGTCCACGGGAAAGACAGGCAGGCAGTATCACTCATTGTiNOSGAGTGACGGCAAACATGACTTCGCCATCGGGCATCTGGTAIL-12CACCCTTGCCCTCCTAAACCACACCTGGCAGGTCCAGAGAIL-10CAGCCGGGAAGACAATAACTGCGCAGCTCTAGGAGCATGTGArg-1GCTCCAAGCCAAAGTCCTTAGACCTCGAGGCTGTCCTTTTGAβ-actinTGGAATCCTGTGGCATCCATGAAACTAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG

注：iNOS：诱导型一氧化氮合成酶；Arg-1：1型精氨酸酶。

1.4.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组pMφ 弓形虫感染后TNF-α、IL-10、IL-12的分泌水平 采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术，按ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.4.6Griess方法检测弓形虫感染前后各组pMφ NO的分泌水平 按试剂盒说明书进行操作。

1.4.7流式细胞术检测弓形虫感染前后各组 pMφ 表面分子(CD80、CD86、CD206、TLR4、TLR2、MHCⅡ)的表达水平 胰酶消化收集各组细胞，洗涤后，加入含封闭抗体(CD16/32)的细胞洗液80 μL，混匀，冰浴10 min；加入各管相应的 Ab(CD80/CD206/TLR4；CD86/MHCⅡ/TLR2)20 μL，漩涡混匀，4 ℃，避光35 min；加入含1%多聚甲醛的 PBS 固定液0.5 mL，上流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1小鼠基因型的鉴定 以PCR鉴定本实验用小鼠为C57BL/6 WT 和IL-33-/-小鼠。

2.2小鼠pMφ 纯度鉴定 FITC-CD14染色检测纯度为95%左右(图1)。

图1 小鼠pMφ鉴定(左)及同型对照(右)Fig.1 Identification of pMφ

2.3小鼠pMφ 感染率比较 C57BL/6 WT和IL-33-/-小鼠pMφ 感染弓形虫速殖子30 min后，IL-33-/-小鼠pMφ 感染率低于WT小鼠(数值分别为0.95±0.01及0.98±0.01，t=-2.49,P<0.05)，提示IL-33-/-小鼠pMφ 抗弓形虫感染能力增强。

2.4IL-33-/-和弓形虫感染对小鼠pMφ M1型标志物表达的影响

2.4.1IL-33-/-对pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/-感染组pMφ 上清液中NO的浓度(F=29.71,P<0.05)及细胞表面MHCⅡ(F=19.05,P<0.05)、TLR4(F=8.34,P<0.05)阳性百分率高于WT感染组，提示IL-33-/-促进弓形虫感染的小鼠pMφ 分泌NO，表达MHCⅡ和TLR4分子；而TLR2阳性百分率表达则相反(F=14.88,P<0.01)，提示IL-33-/-抑制了pMφ TLR2的表达；IL-33-/-小鼠感染组pMφ iNOS(F=0.96,P<0.01)、IL-1(F=0.83,P<0.01)、IL-12 mRNA(F=1.32,P<0.01)的表达，TNF-α 的分泌(F=0.98,P>0.05)及表面分子CD80(F=0.23,P>0.05)、CD86的表达(F=0.02,P>0.05)与WT小鼠感染组比较均无统计学差异，见表3。

2.4.2弓形虫感染对小鼠pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/-和WT小鼠感染组pMφ TNF-α(F=11.56,P>0.05)、NO分泌水平(F=16.68,P>0.05)及CD86(F=13.43,P>0.05)、TLR4(F=57.57,P>0.05)、MHCⅡ(F=34.34,P>0.05)表面分子的表达均高于各自未感染对照组，提示感染促进了IL-33-/-和WT小鼠pMφ 上述炎性介质及表面分子的表达；弓形虫感染对IL-33-/-和WT小鼠pMφ iNOS(F=0.69,P>0.05)、IL-1(F=0.02,P>0.05)、IL-12 mRNA(F=2.46,P>0.05)表达及表面分子CD80(F=1.87,P>0.05)、TLR2(F=3.33,P>0.05)表达的比较均无统计学差异，见表3。

表3 pMφ M1型标志物检测结果比较

Tab.3 Expression of pMφ M1 marks

M1标志物No.IL-33-/-感染组IL-33-/-空白组WT感染组WT空白组mRNA表达IL-160.75±0.310.90±0.370.78±0.320.52±0.21(2-△△CT)iNOS63.80±1.556.77±2.771.98±0.813.63±1.48IL-1262.20±0.901.62±0.660.61±0.270.51±0.23分泌浓度IL-1210未检出未检出未检出未检出(pg/mL)TNF-α101732.49±325.17**1602.31±247.941488.35±757.99**1324.04±623.64NO(μmol/L)1031.62±14.47**b28.46±12.6015.77±9.16**11.94±9.62表面分子表达CD80678.72±12.2270.75±15.0277.74±8.2477.90±8.98(%)CD86690.53±6.67**61.69±8.0850.49±22.99**37.86±12.74TLR461.84±0.43**a1.26±0.571.06±0.27**0.63±0.28TLR2654.44±9.88b57.75±10.4964.20±17.7742.29±0.23MHCⅡ658.07±10.76**b53.97±13.8343.20±13.73**34.99±11.20

注：与各自未感染对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与WT感染组比较，aP<0.05，bP<0.01。

2.4.3IL-33-/-和弓形虫感染双因素对小鼠pMφ M1型标志物表达的影响 IL-33-/-和感染双因素对小鼠pMφ MHCⅡ分的表达有交互促进作用(F=5.25,P<0.05，图2)，而对TLR2的表达则是明显的交互抑制作用(F=14.88,P<0.01，图3)，提示IL-33-/-促进弓形虫感染的小鼠pMφ 表达MHCⅡ分子，而抑制TLR2的表达。 IL-33-/-和感染双因素对IL-33-/-小鼠与WT小鼠间iNOS、IL-1、IL-12mRNA、TNF-α、NO、CD80、CD86、TLR4的表达无交互影响。

图2 IL-33敲除与感染对小鼠 pMφ MHCⅡ表达的交互作用Fig.2 Interaction of IL-33 knockout and infection on the expression of MHCⅡon pMφ

图3 IL-33敲除与感染对小鼠 pMφ TLR2表达的交互作用Fig.3 Interaction of IL-33 knockout and infection on the expression of TLR2 on pMφ

2.5IL-33-/-和弓形虫感染对小鼠pMφ M2型标志物表达的影响 与WT感染组比较，IL-33-/-感染组小鼠pMφ CD206的表达降低(t=-3.34,P<0.01)；而弓形虫感染促进了WT和IL-33-/-小鼠pMφ IL-10的分泌(F=6.18，P<0.05)；IL-33-/-和感染双因素对小鼠pMφ Arg-1、IL-10 mRNA、CD206、IL-10的表达无交互作用，见表4。

表4 pMφ M2型标志物检测结果比较

Tab.4 Expression of pMφ M2 marks

M2标志物No.IL-33-/-感染组IL-33-/-空白组WT感染组WT空白组IL-10(2-△△CT)61.45±0.592.09±0.852.34±0.951.44±0.596Arg-1(2-△△CT)60.64±0.261.10±0.450.82±0.330.45±0.18IL-10(pg/mL)106229.70±3673.16*5811.18±3484.134637.62±1645.85*4395.06±1469.16CD206(%)612.00±3.88**12.03±2.9614.96±2.5617.38±6.41

注：与各自未感染对照组比较，*P<0.05；与WT感染组比较，**P<0.01(独立样本t检验)。

3 讨 论

弓形虫感染pMφ 后，会劫持宿主细胞器进行繁殖[19]，最终导致大量宿主细胞裂解破碎。本实验弓形虫感染pMφ 30 min后IL-33-/-小鼠pMφ 胞内速殖子的数量少于WT小鼠，提示IL-33-/-小鼠pMφ 与WT小鼠比较，抗弓形虫感染的能力增强。因此，本研究于弓形虫感染小鼠pMφ 24 h后同时检测pMφ mRNA的表达水平、细胞培养液中细胞因子和炎性介质的分泌水平、细胞表面标志性分子的表达水平，以达到比较客观的观察在IL-33-/-与弓形虫感染双因素作用下小鼠pMφ 的变化。IL-33-/-小鼠感染组细胞培养液中NO明显升高(F=16.68，P<0.01)，提示感染早期IL-33-/-促进pMφ 生成NO，后者可与Mφ 氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物结合，产生杀伤微生物的过亚硝酸盐基[18,20]。弓形虫感染明显促进了感染组小鼠pMφ NO及TNF-α 的分泌，提示弓形虫感染增强了小鼠pMφ 的抗炎活性。而Real-time PCR检测弓形虫感染后小鼠pMφ iNOS、Arg-1、IL-1、IL-10、IL-12 mRNA表达水平显示，IL-33-/-和感染对各个指标mRNA表达水平变化无统计学意义，结合细胞培养液中NO和IL-10含量明显升高的变化，可能与检测的时间点滞后有关系。

弓形虫蛋白会抑制 γ-干扰素激活的Mφ 表达MHCⅡ类分子[21-22]，而在本次研究中却观察到感染组小鼠pMφ 表面MHCⅡ类分子表达明显高于未感染对照组，分析结果显示：IL-33-/-小鼠pMφ弓形虫感染后MHCⅡ类分子的表达高于WT型感染组。同时，感染组小鼠pMφ CD86分子也明显高于未感染对照组。MHCⅡ类分子为激活CD4+T细胞提供第一信号，而CD86是CD28的配体，提供T细胞激活的共刺激信号。感染组小鼠pMφ 表面MHCⅡ类分子和CD86分子表达增高，提示弓形虫感染可能增强了CD4+T细胞激活的双信号，促进 T细胞的生长和分化。由于弓形虫为胞内寄生原虫，细胞免疫在整个抗弓形虫感染过程中发挥了极其重要的作用。CD4+T细胞在抗弓形虫感染中发挥重要的免疫调节作用，而CD8+T细胞发挥细胞杀伤作用[18]。本课题组前期的研究发现急性弓形虫感染时WT小鼠CD4+T细胞/CD8+T细胞比例逐渐降低，随着感染进展CD8+T细胞在数量上比CD4+T细胞占优势。而IL-33-/-小鼠则刚好相反。这一点和文献报道的弓形虫脑炎时NF-κB-/-小鼠脑中CD8+T细胞数量少于野生型小鼠相符[23]。因此IL-33-/-可能通过促进M1巨噬细胞CD86、MHCⅡ类分子的表达促进CD4+T细胞发挥免疫调节作用。

Toll样受体是一类跨膜受体，可识别并结合相应的病原体相关的分子模式(PAMP)，在弓形虫感染中主要通过启动TLR/MyD88信号传导途径[24]，诱导某些炎症介质(如细胞因子)和某些杀菌分子(如NO等)，介导炎性反应并发挥杀寄生虫作用[25-26]。弓形虫糖基磷脂酰肌醇类(GPIs)可活化TLR2和TLR4[24]。我们发现感染组小鼠pMφ TLR4表达明显高于对照组，IL-33-/-促进了小鼠pMφ TLR4的表达。但在本次实验中，IL-33-/-小鼠感染组pMφ TLR2的表达明显低于WT感染组。Mun HS等观察到TLR2敲除小鼠口服感染弓形虫无毒株包囊后8 d内全部死亡，而TLR4敲除小鼠及野生型小鼠则全部存活；发现TLR2敲除小鼠 pMφ 感染弓形虫后未能产生NO和 γ-干扰素等抗弓形虫感染的炎性介质[27]。本实验 IL-33-/-小鼠pMφ 感染弓形虫后表面受体TLR2表达降低是否与受体内化有关还有待后续进一步研究。

综上所述，在急性弓形虫感染早期，IL-33-/-小鼠pMφ 高表达MHCⅡ类分子、NO、TLR4、CD86等M1型标志，而M2型标志物CD206表达降低。提示IL-33-/-可能通过调控Mφ 向M1亚群分化，分泌NO等活性介质，表达MHCⅡ类分子、CD86等分子参与抗弓形虫免疫应答。

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