5-羟色胺诱导冠状动脉收缩的机制研究*

王 昊， 邓春玉， 饶 芳， 邝素娟， 杨 慧， 刘 林， 吴 琪， 徐劲松△

(1南昌大学第二附属医院， 江西 南昌 330006; 2广东省人民医院医学研究部，广东省医学科学院， 广东省心血管病研究所， 广东 广州 510080)

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)作为神经递质，主要分布于松果体和下丘脑,但其亦可作为自体活性物质，储存于肠嗜铬细胞颗粒内。在刺激因素作用下，5-HT释放进入血液，被血小板摄取和储存，并可促进血小板聚集、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖和血管收缩。因此，5-HT可能在动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等疾病的病理过程中发挥作用，进而促进心血管事件的发生[1]。

近年来的研究发现，5-HT参与诱导许多重要动脉的收缩。如有研究者发现，5-HT可通过激活三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)-Ca2+信号通路和二酰甘油(diacylglycerol，DAG)-蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信号通路，诱导胸主动脉收缩[2]，并可以通过激活RhoA/Rho激酶和Src激酶刺激肠系膜动脉收缩[3]。此外，5-HT亦可诱导基底动脉收缩，其机制可能与线粒体单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)介导过氧化氢生成增加有关[4]，5-HT还可通过磷脂酶C(phospholipase C，PLC)/Orai1信号通路诱导冠状动脉收缩[5]，以上研究结果提示5-HT通过参与多种信号通路诱导血管收缩，且机制不尽相同，而5-HT诱导冠状动脉收缩的机制研究较少，有待进一步阐明。

因此，本研究通过给予不同信号通路的抑制剂，观察5-HT诱导大鼠离体冠状动脉血管张力的变化，以研究5-HT诱导冠状动脉收缩的可能机制。

材 料 和 方 法

1 动物

SPF级雄性Wistar成年大鼠，体重300～350 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2016-0041。

2 主要试剂和仪器

5-HT、沙格雷酯(sarpogrelate)、U73122、硝苯地平(nifedipine)、SKF96365，2-氨基乙氧基苯硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate，2-APB)和卡马拉素(rottlerin)均购自Sigma；其余试剂均为国产分析纯。其中，nifedipine溶于DMSO，其余均溶于水。Krebs-Henseleit (K-H) 溶液(mmol/L)： NaCl 119、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 4.7、KH2PO41.2、CaCl22.5和D-Glucose 11.1；高钾K-H溶液(mmol/L)：NaCl 63.7、NaHCO325、MgCl2·6H2O 1、KCl 60、KH2PO41.2、CaCl22.5和D-Glucose 11.1，所用溶液配好通混合气(含95%O2+5% CO2)充分饱和，调pH约为7.4。

610M型多通道血管张力测定仪(DMT)；Power Lab 8/30生物信号采集处理系统(AD)；DK-8D型电热恒温水槽(上海医用恒温设备厂)；Stemi DV4型体视显微镜(ZEISS)。

3 主要方法

3.1大鼠离体冠状动脉环的制备 采用CO2处死大鼠，用胶带固定在木板上，打开胸腔充分暴露心脏，取下大鼠的心脏。将取出的心脏立即放入4 ℃ 预冷，经混合气体(95% O2+ 5% CO2)饱和的K-H液中，并将心脏固定在玻璃皿中的硅胶板上。在冰浴条件下显微操作分离冠状动脉，小心去除冠脉周围的心肌组织，尽量避免钳夹、牵拉冠脉，以防损伤血管平滑肌，从而影响血管张力。将游离的冠状动脉剪成长度为1.8～2.0 mm的血管环。将血管环穿上2根直径40 μm的不锈钢丝，并平行固定在张力仪浴槽内的2个钳夹上，1个钳夹连接到螺旋测微器，用于调整冠脉的周长，另1个钳夹连接到内置的高灵敏度张力传感器，观察和测定血管环张力的变化。浴槽内预先放置5 mL 37 ℃ 预温的K-H液。对于冠状动脉，设定并调节基础张力至1.5 mN，平衡60 min，期间每隔15 min换液1次，并使张力维持在1.5 mN。在加入不同药物后，血管张力信号通过张力传感器，再经数模转换器输入计算机，完成张力记录。实验过程中槽内温度控制在(37±0.5) ℃，并往槽内持续通入95% O2和5% CO2的混合气体[6-7]。

3.2血管反应性及内皮完整性的测定 首先用高钾溶液刺激血管，检测血管的反应性。把浴槽内的K-H 液换成高钾K-H 液，使冠脉产生张力，维持5 min 后，充分冲洗(冲洗4次，每次间隔5 min)至基线，静息30 min 后，重复上述实验。前后2次高钾刺激后，血管收缩的幅度相差不超过10%可用于下一步实验。为检测血管内皮的完整性，重新平衡血管环30 min，先用血管收缩剂100 nmol/L U46619 引起血管持续性收缩，再加入血管舒张剂1 μmol/L 乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)，若血管的舒张幅度大于60%，视为内皮完整，若ACh不能使预先收缩的血管舒张，或者舒张程度小于10%，说明内皮去除完全。

4 统计学处理

以2次高钾诱发收缩张力的均值作为标准值(100%)，各血管收缩剂诱发的张力变化的幅度用百分比来表示; 血管舒张剂是以收缩剂诱发的最大稳定收缩幅度定为标准值(100%)，血管舒张/收缩的幅度以占标准值的百分比来表示，半数有效浓度(median effect concentration，EC50)表示产生 50% 最大效应时的药物浓度, pEC50= -lg(EC50)。采用 Prism 5.0软件对数据进行曲线拟合，绘制收缩及舒张曲线，求得 lgEC50和最大收缩或舒张百分比的变化值(Emax)。用SPSS 11.0统计软件分析，数据均采用均数±标准误(mean±SEM)表示。两组之间的显著性差异应用双侧t检验进行分析，多组间均数比较用单因素方差分析，组间均数的两两比较使用LSD法和SNK法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 5-HT2A受体阻断剂和PLC抑制剂对5-HT诱导的冠状动脉收缩反应的影响

给予单剂量(2 μmol/L) 5-HT使冠状动脉收缩，达到平台后，用5-HT2A受体阻断剂sarpogrelate (1 μmol/L)可完全阻断5-HT引起的冠状动脉收缩(P<0.01)，见图1A、B。

采用累积给药法加入5-HT(0.01～10 μmol/L)，可诱导冠状动脉呈浓度依赖性收缩；K-H液洗4次后，加入PLC特异性抑制剂U73122 (10 μmol/L和50 μmol/L),孵育30 min，结果发现2个浓度的U73122均可阻断5-HT引起的冠状动脉收缩(P<0.01)，见图1C、D及表1。

Figure 1. The effect of sarpogrelate and U73122 on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of vasoconstriction induced by 5-HT, then upon addition of sarpogrelate; B: sarpogrelate at 1 μmol/L significantly inhibited the contraction induced by 5-HT; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT; D: U73122 at 10 μmol/L and 50 μmol/L significantly inhibited the contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner. Mean±SEM.n= 4.△△P<0.01vs5-HT group;**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsU73122 10 μmol/L group.

图15-HT2A受体阻断剂sarpogrelate和PLC抑制剂U73122对5-HT诱导的冠脉收缩的影响

2 Rottlerin 和Y-27632对5-HT诱导的冠状动脉收缩反应的影响

2.1Rottlerin可抑制5-HT诱导的冠状动脉收缩反应 用上述方法记录5-HT累积给药后冠状动脉张力变化，再加入PKC抑制剂rottlerin 3 μmol/L和10 μmol/L孵育30 min。结果发现10 μmol/L的rottlerin可阻断5-HT引起的冠状动脉收缩(P<0.01)，见图2A、B及表1。

2.2Y-27632可抑制5-HT诱导的冠状动脉环的收缩反应 同法记录5-HT累积给药后冠状动脉张力变化，再加入Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632 3 μmol/L和10 μmol/L孵育30 min。结果发现2个浓度的Y-27632均可明显阻断5-HT引起的冠状动脉收缩(P<0.01)，见图2C、D及表1。

表1 5-HT诱导的冠状动脉收缩的pEC50和Emax (%)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vslow concentration group.

Figure 2. The effect of rottlerin and Y-27632 on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of rottlerin; B: rottlerin at 10 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of Y-27632; D: Y-27632 at 3 μmol/L and 10 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT. Mean±SEM.n=8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsrottlerin 3 μmol/L group.

图2PKC抑制剂rottlerin和Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632对5-HT诱导的冠脉收缩的影响

3 Nifedipine可抑制5-HT诱导的冠状动脉环收缩反应

同法记录5-HT累积给药冠状动脉张力变化，再加入L-型钙通道阻断剂nifedipine 1 μmol/L孵育30 min，结果发现nifedipine可明显阻断5-HT引起的冠状动脉收缩，见图3、表1。

Figure 3. The effect of nifedipine on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT; B: nifedipine at 1 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsnifedipine 1 μmol/L group.

图3L-型钙通道阻断剂nifedipine对5-HT诱导的冠脉收缩的影响

4 SKF96365和2-APB对5-HT诱导的冠状动脉收缩反应的影响

4.1SKF96365可抑制5-HT诱导的冠状动脉环的收缩反应 同法记录5-HT累积给药后冠状动脉张力变化，再加入钙库操纵性钙内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)抑制剂SKF96365 10 μmol/L和30 μmol/L孵育30 min。结果发现2个浓度的SKF96365均可阻断5-HT引起的冠状动脉收缩，见图4A、B及表1。

4.22-APB可抑制5-HT诱导的冠状动脉环的收缩反应 同法记录5-HT累积给药后血管张力的变化，再加入SOCE抑制剂2-APB 50 μmol/L和100 μmol/L孵育30 min。结果发现给予的2个浓度2-APB均可阻断5-HT引起的冠状动脉收缩，见图4C、D及表1。

讨 论

本研究发现5-HT2A受体阻断剂sarpogrelate可完全消除5-HT引起的冠状动脉收缩；PLC抑制剂U73122、Rho相关蛋白激酶抑制剂Y-27632和PKC抑制剂rottlerin均可明显抑制5-HT引起的冠状动脉收缩；L型钙通道(Cav1.2)阻断剂nifedipine及SOCE抑制剂SKF96365和2-APB孵育后，5-HT诱导血管收缩张力较未处理组明显下降；同时，在含nifedipine的无钙K-H液中，发现5-HT仍可诱导血管收缩。

Sarpogrelate为5-HT2A受体阻断剂，具有抑制血小板聚集的作用，已应用于多种心血管疾病的治疗，如糖尿病、冠心病和动脉粥样硬化等。5-HT受体包括7个类型(5-HT1-7)，除了5-HT3受体家族属于配体门控阳离子通道，其它5-HT受体家族均属于跨膜G蛋白偶联受体。而参与冠状动脉收缩的相关受体主要有5-HT1B和5-HT2A[8-9]，本实验给予sarpogrelate干预后发现可完全消除5-HT引起的冠状动脉收缩，提示冠状动脉中是5-HT2A受体介导5-HT效应。

研究发现，5-HT可与VSMCs的细胞膜相应受体结合，激活PLC，使磷脂酰肌醇二膦酸(phosphatidylinositol bisphosphate，PIP2)分解为IP3和DAG。IP3与受体结合，使内质网上Ca2+排空，激活Ca2+内流通道，从而介导外钙内流，诱导血管收缩[10]。DAG激活PKC，使PKC增强性抑制蛋白17磷酸化，抑制肌球蛋白轻链磷酸酶活性，使其不易去磷酸化，导致平滑肌产生收缩增强[11]。U73122为PLC抑制剂，通过抑制PIP2水解为IP3，使细胞内Ca2 +的下降；Y-27632为Rho相关蛋白激酶特异性抑制剂，可靶向结合ROCK-1和ROCK-2的催化位点，从而抑制其活性[12]。本实验分别给予PLC/PKC/Rho激酶通路的抑制剂干预，发现均可明显抑制5-HT引起的冠状动脉环收缩，提示冠状动脉中5-HT2A受体介导冠脉收缩可能与PLC/PKC/Rho激酶信号通路有关。

此外，Ca2+作为第二信使，在平滑肌细胞中参与细胞收缩过程[13]。细胞内Ca2+通过与钙调蛋白结合后激活肌球蛋白轻链激酶，使肌球蛋白轻链磷酸化，导致肌动蛋白和肌球蛋白相互作用引起血管收缩。细胞膜上参与细胞内外钙离子交换的主要通道有：电压操纵性钙通道(voltage-gated calcium channel, VGCC)、SOC和受体操纵性钙通道(receptor operated calcium channel, ROCC)[14]。Sung等[15]发现在大鼠肠系膜动脉中，硝苯地平可显著降低5-HT诱导的动脉收缩。细胞内Ca2+浓度紊乱可引起冠状动脉收缩功能障碍。为研究冠状动脉VSMCs外钙离子交换的主要通道，本实验给予钙通道阻滞剂nifedipine，可阻断L-型钙通道抑制钙内流进入VSMCs；SKF96365和2-APB为SOCE抑制剂，可阻断SOCE从而降低胞质Ca2+，减少细胞外钙的进入[16]。本研究发现nifedipine、SKF96365和2-APB孵育后，5-HT诱导血管收缩张力较未处理组均明显下降；同时，在含nifedipine的无钙K-H液中，发现5-HT仍可诱导血管收缩，说明Cav1.2、SOC和内质网Ca2+释放可能与5-HT介导的冠状动脉收缩有关。

Figure 4. The effect of SKF96365 and 2-APB on vasoconstriction induced by 5-HT in endothelium-denuded coronary arterial rings from Wistar rats. A: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of SKF96365; B: SKF96365 at 10 μmol/L and 30 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner; C: representative recordings of concentration-dependent vasoconstriction induced by 5-HT in the presence of 2-APB; D: 2-APB at 50 μmol/L and 100 μmol/L significantly inhibited contraction induced by 5-HT in a dose-dependent manner. Mean±SEM.n=10.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSKF96365 10 μmol/L group;△△P<0.01vs2-APB 50 μmol/L group.

图4SOCE抑制剂SKF96365和2-APB对5-HT诱导的冠脉收缩的冠脉收缩的影响

本实验通过对大鼠冠状动脉张力的测定，发现5-HT通过激活5-HT2A受体诱导冠状动脉收缩，可能与PLC/PKC/Rho信号通路，以及L-型钙通道和SOC通道相关的钙调控有关，为相关疾病的治疗用药带来更多选择。但本实验仅对离体大鼠冠状动脉进行了分析，并未在细胞学水平对可能参与的信号通路进行深入研究，以进一步确定其上下游关系；且大鼠与人的冠状动脉存在种属间的差异，是其局限性。

[参 考 文 献]

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