上调人食管癌Eca109细胞Shh-Gli1信号通路对放射抗拒性及细胞周期的影响*

余今菁， 贺昱霖， 刘佳琪， 姚 菲， 刘 群， 龙 辉， 吴清明△

(武汉科技大学 1医学院， 2职业危害识别与控制湖北省重点实验室， 3附属天佑医院消化内科， 湖北 武汉 430065； 4十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院生物医学研究所， 湖北 十堰 442000)

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤[1-2]，发病率高，预后较差。对于晚期食管癌患者，放射治疗联合手术是最好的治疗手段之一[3]，但放射治疗可能导致肿瘤细胞放射抗拒性的产生，从而影响放疗疗效。有研究指出，消化道肿瘤的发生与Sonic Hedgehog(Shh)信号通路的异常激活有关，食管鳞状细胞癌中存在Shh信号通路相关因子的高表达，Shh信号通路下游转录因子Gli1抑制剂能够增强食管癌细胞的放射敏感性[4-5]。

本课题组前期研究发现，食管癌放射抗拒株Eca109R细胞中Gli1与Shh蛋白表达明显高于亲本株Eca109[6]，表明食管癌放射抗拒性的产生可能与Shh信号通路相关蛋白过表达有关。然而Shh信号通路如何通过其下游转录因子Gli1影响食管癌细胞放射抗拒性的机制尚不明了。因此，本实验通过上调亲本株Eca109细胞中关键因子Gli1的表达，检测食管癌细胞放射敏感性与细胞周期的变化，探究Shh信号通路相关因子与食管癌放射抗拒性及细胞周期改变之间的关联。

材 料 和 方 法

1 材料

人食管癌细胞株Eca109(十堰太和医院惠赠)；DMEM培养基(Gibco)；胎牛血清(杭州四季青公司)；QuantiFast SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN)；细胞周期试剂盒(联科公司)；抗Gli1抗体(北京博奥森公司)；过表达Gli1质粒(吉凯公司)。CO2培养箱和超净工作台(Thermo Fisher)。

2 方法

2.1细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱内培养。

2.2实验分组 用由Eca109细胞中扩增出的Gli1序列构建的Gli1过表达质粒转染Eca109细胞，命名为Eca109-ox-Gli1组；同时Eca109细胞转染空载质粒作为阴性对照(negative control)组；另设不做处理的亲本株Eca109细胞作为正常对照(normal control)组。

2.3过表达质粒转染 转染前一天将细胞以每孔6×105个的密度接种于6孔板内，确保第2天转染时细胞达到70%的汇合度。用125 μL Opti-MEM培养基稀释5 μL Lipofectamine 2000试剂。用125 μL Opti-MEM培养基稀释2.5 μg质粒。将稀释的质粒与稀释的Lipofectamine 2000试剂混合(1∶1比例)，孵育5 min。将混合的质粒-脂质体复合物加至细胞中，再加入完全培养基，使终体积达2 mL。转染后24 h可通过荧光显微镜观察到转染成功的细胞。

2.4Real-time PCR实验 根据TRIzol说明书提取个组细胞的总RNA并定量。取总RNA 2 μg经SuperScript III Reverse Transcriptase逆转录反应得到终体积20 μL的cDNA，采用SYBR Green实时荧光定量PCR试剂盒，按说明书所述检测细胞中Gli1的mRNA表达。PCR体系为：12.5 μL SYBR Green PCR Msater Mix、5 μL RT逆转录产物、1 μL正向及反向引物。反应条件为：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循环40次。β-actin作为内参照，采用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。Gli1的上游引物序列为5’-CGCCTCGAAAACCTGA-3’， 下游引物序列为5’-GGGAGCTTACATACATACGG-3’； β-actin的上游引物序列为5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTCT-3’， 下游引物序列为5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。

2.5Western blot检测Gli1蛋白的表达 采用现配的含有1% PMSF的RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。蛋白煮沸变性，冷却至室温后上样，每孔35 μg，SDS-PAGE 2 h，转膜后5%脱脂奶粉封闭2 h，I 抗4 ℃孵育过夜，隔日用现配1×TBST洗膜3次，II抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化学发光法检测蛋白的表达，计算相对灰度值。实验重复3次。

2.6集落形成实验测细胞的放射敏感性 将指数生长期细胞消化计数，制成单细胞悬液，按每孔400、400、800、1 000和1 200的密度梯度接种于6孔板，待细胞贴壁且状态良好(约12 h)，每板分别以0、2、4、6和8 Gy的剂量进行细胞照射，继续培养14 d，出现肉眼可见的细胞集落时认为集落已形成，终止培养。甲醇固定，结晶紫染色，计数含50个及以上细胞的集落数，用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，计算细胞放射敏感性参数：平均致死剂量(D0)、准阈剂量(Dq)、外推值(N值)及照射2 Gy后细胞存活分数(survival fraction at dose of 2 Cy,SF2)。实验重复3次。

2.7细胞照射 采用Varian 2300直线加速器对细胞进行6 MV的X射线放射处理，每次放射剂量为200 cGy，照射视野面积为6 cm×4 cm，照射源距细胞培养瓶80 cm，培养瓶表面覆盖1.5 cm厚的补偿块，吸收剂量率为2 Gy/min。取指数生长期Eca109细胞1瓶，用直线加速器照射1 min，放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长状况，待细胞状态稳定，并开始逐步恢复正常生长时，可进行细胞传代，继续培养至对数生长期时，可再次进行放射处理。

2.8细胞周期检测 使用联科生物细胞周期检测试剂盒，收集1×106个细胞，离心后70 %的冷乙醇1 mL 4 ℃固定过夜。隔日弃去固定液，PBS重悬细胞15 min，室温离心5 min，弃上清。加入1 mL DNA Staining Solution，涡旋振荡10 s混匀，室温避光孵育30 min。使用流式细胞仪进行检测。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计分析。实验所涉及的数据均采用均数±标准差(mean±SD)的形式表示，多组间比较采用单因素方差分析，应用Bonferroni校正的t检验进行组间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Real-time PCR检测转染后3组细胞中Gli1的mRNA表达水平

用Real-time PCR法检测转染后3组细胞内Gli1的mRNA表达水平，以β-actin作为内参照。结果显示，Eca109-ox-Gli1组与negative control组和normal control组相比，Gli1的mRNA表达明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1. The mRNA expression levels of Gli1 in the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups.

图1转染后3组细胞中Gli1mRNA表达水平的比较

2 Western blot法检测转染后3组细胞中Gli1蛋白表达

Gli1蛋白的相对分子质量是118 kD，内参照蛋白β-actin的相对分子质量是42 kD。结果显示，Eca109-ox-Gli1组较2组对照细胞的Gli1蛋白表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

Figure 2. The protein expression levels of Gli1 in the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups.

图2转染后3组细胞中Gli1蛋白表达水平的比较

3 上调Gli1对Eca109细胞放射敏感性的影响

转染后的3组细胞分别接受0 Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy和8 Gy剂量的单次照射，利用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，可见Eca109-ox-Gli1组相比2个对照组对应剂量的细胞存活分数明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，且D0和Dq均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3、表1。这表明Eca109-ox-Gli1组细胞放射敏感性明显减弱，放射抗拒性增强。

Figure 3. The survival curves of the esophageal cancer cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol groups at the same dose.

图3单击多靶模型拟合细胞存活曲线

表1 转染细胞放射生物学参数的比较

*P<0.05,**P<0.01vscontrol groups.

4 上调Gli1对细胞周期的影响

转染后的3组细胞分别接受6 Gy剂量的单次照射后继续培养48 h后，检测细胞周期，结果显示，3组细胞在照射前，Eca109-ox-Gli1组中S期细胞分布比例显著高于对照组(P<0.01)，G2/M期细胞分布低于对照组(P<0.05)，说明上调Gli1的细胞放射抗拒性相对增强，可能是由于对X射线最为抗拒的S期细胞比例增多所致。6 Gy的X射线照射后，3组细胞均出现G2/M期阻滞，表明细胞在进行自身损伤修复，照射后normal control组相比于Eca109-ox-Gli1组G2/M期细胞比例显著增高(P<0.01)，说明相比具有放射抗拒性的Eca109-ox-Gli1转染细胞，亲本Eca109细胞积极地促进细胞进入对放射敏感的G2/M期，放射治疗更为有效，见表2、3。

表2 转染后3组细胞X射线照射前的细胞周期分布

*P<0.05,**P<0.01vscontrol groups.

表3 转染后3组细胞X射线照射后的细胞周期分布

**P<0.01vsnormal control group.

讨 论

Shh信号转导通路由Shh配体、跨膜蛋白受体Ptch和Smo及下游核转录因子Gli组成，其中Gli锌指蛋白家族包括Gli1、Gli2和Gli3。研究表明，Shh信号通路一般在正常成人组织器官中低表达、甚至不表达，仅在参与组织的修复时激活，而在多种肿瘤中均发现存在该通路的异常激活[7-9]。Yang等[10]发现食管癌前病变中Ptch1和Gli2蛋白表达增高，96%的食管腺癌患者存在Shh信号通路的异常激活，表明Shh信号通路的异常激活在食管癌的发生发展中起重要作用。有研究报道[11]，43例出现放化疗抗拒的食管癌细胞株中有36例(83.7%)检测出Gli1阳性，表明食管癌放化疗抗拒性与Hh通路的激活有关。近年来，有关肿瘤细胞放射抗拒机制的研究涉及多种复杂因素，包括细胞周期紊乱、DNA的损伤与修复、细胞的凋亡与分化、放射致细胞信号转导通路改变及血管形成等[12]。

在正常情况下，跨膜蛋白质受体Ptch和Smo组成受体复合物，Smo的活性受到抑制；当Shh配体激活时，Shh与Ptch结合，Smo释放进入细胞内，激活信号通路下游转录因子Gli1，调节Wnt、cyclin D1、N-Myc等多种靶基因表达，引起细胞周期改变和细胞增殖与凋亡[13]。有研究发现[14]，抑制细胞周期调控因子CDC25在食管癌细胞中的过度激活后进行细胞照射，G2/M期细胞的阻滞程度下降，放射敏感性提高，表明食管癌细胞的放射抗拒性可能与细胞周期的改变有关。Rizvi等[15]的研究显示，CDK2启动子序列在过表达Gli1质粒转染的细胞中富集，并且在Gli1过表达组中活性相比对照组增加多达5倍，说明Gli1与CDK2启动子结合并充当CDK2的转录激活剂。Simsmourtada等[11]发现，cyclin D1在受Shh信号刺激的SEG-1细胞中表达增高；抑制Hh信号后细胞周期进展受到抑制，G1/S监测点蛋白cyclin D1和周期蛋白依赖性激酶4的表达量减少，细胞大量停留在G1期，肿瘤的放射敏感性增强。因此，对细胞周期的研究可能是探究Shh信号通路影响肿瘤放射抗拒性机制的一个关键点。

我们的前期研究发现[6]，食管癌放射抗拒株细胞活力较亲本株下降，Shh和Gli1蛋白在放射抗拒细胞株中高表达，且Gli1明显向细胞核聚集。本研究在原有基础上，为进一步明确Shh信号通路影响食管癌细胞放射抗拒的机制，我们通过构建过表达Gli1质粒对Eca109细胞进行转染，发现转染后Gli1表达水平相比转染前增加，同时集落形成实验显示，转染过表达Gli1质粒后细胞放射敏感性减弱，放射抗拒性增强，印证了Shh信号通路与食管癌的放射抗拒性是密切相关的。同时，我们通过检测3组细胞照射前后细胞周期的变化，发现Gli1过表达细胞株S期细胞分布显著增加，G2/M期细胞减少，而放射毒性效应依赖于细胞周期，G1期和G2/M期细胞对射线敏感，S期的细胞对射线最为抗拒，即过表达细胞对射线敏感的细胞减少，放射抗拒性增强。X射线照射后，亲本株Eca109细胞G2/M期细胞分布的增加较过表达细胞更为显著，说明亲本株细胞更能促进细胞进入放射敏感的M期，放射治疗对其更为有效。

综上所述，本文通过上调Gli1进一步探究了Shh信号通路激活与食管癌细胞放射抗拒性之间的关系，比较了上调Gli1细胞与亲本细胞放射前后细胞周期的变化。由此可见，细胞周期改变可能与Shh/Gli1通路影响食管癌放射抗拒性增高密切相关。

[参 考 文 献]

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