miR-30c抑制宫颈癌细胞恶性表型的分子机制研究

金 虹， 张 萌， 刘 念， 李 珊

(新疆医科大学第一附属医院母胎医学中心产科， 新疆 乌鲁木齐 830011)

宫颈癌是全球八大恶性肿瘤之一，是造成全世界妇女死亡的第二大病因。流行病学资料显示，全球每年有近53万宫颈癌新增病例，其中80%的患者发生在发展中国家[1-2]，中国是宫颈癌高发国家之一，发病率和死亡率呈逐年增加趋势[3-4]。目前放疗和化疗仍是宫颈癌的主要治疗手段，体外放疗与腔内放疗联合作用是治疗宫颈癌的标准放射疗法[5]，但这些方法对晚期转移性宫颈癌的预后效果较差，易复发且对放/化疗耐受。因此，寻找和研发有效治疗宫颈癌的靶向药物已成为亟需解决的医研问题。微小RNA(microRNAs，miRNAs，miR)是一类长度为18～25个核苷酸的单链非编码RNA。大量研究证实miRNAs的异常表达与大多数肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤细胞增殖、转移、侵袭，细胞凋亡，周期调控和肿瘤细胞耐药性方面发挥重要作用[6-8]。miR-30c是近新发现的miR-30家族成员，其生物学功能仍不清楚。研究表明miR-30c在不同肿瘤细胞中发挥不同的生物学功能，其异常表达与多种肿瘤的发生发展相关，提示miR-30c是一个肿瘤相关因子[9-13]。目前，miR-30c在宫颈癌发生发展中的功能尚无报道。本研究以宫颈癌细胞为对象，观察miR-30c异常表达对宫颈癌细胞表型的影响，并探讨其分子机制，为以miR-30c为靶点研发治疗宫颈癌的靶向药物提供科学依据。

材 料 和 方 法

1 细胞株与试剂

宫颈癌细胞系C33A、HeLa、SiHa和CaSki购自ATCC；DMEM培养基购自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素和链霉素购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；胰蛋白酶、MTT和DMSO购自Sigma；Transwell板购自Corning；Lipofectamine 2000购自Invitrogen；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自南京博泰生物技术有限公司；抗Bax和Bcl-2抗体购自Cell Signaling Technology；抗基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13、MMP-9和金属蛋白酶组织抑制物1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)抗体购自Abcam；抗GAPDH抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；mirVana miRNA分离试剂盒和TaqMan miRNA试剂盒购自Applied Biosystems；反转录试剂盒(Prime Script® RT reagent kit with gDNA Eraser)和Real-time PCR 试剂盒(SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ)购于TaKaRa；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自Thermo。

2 方法

2.1细胞培养 C33A、HeLa、SiHa和CaSki细胞培养于DMEM培养基(含10% FBS、1%青霉素和1%链霉素)中，置于37 ℃、5% CO2及95%湿度的培养箱中培养至细胞融合度达到90%左右时进行细胞传代。

2.2细胞转染 pGenesil-1-miR-30c表达质粒由本实验室构建和保存。将生长良好的C33A、HeLa、SiHa和CaSki细胞消化计数后，以细胞密度为每孔2.5×105个接种到6孔板中，置于CO2培养箱中，待细胞融合度达到85%左右时按照Lipofectamine 2000说明书进行pGenesil-1-miR-30c细胞转染。转染的细胞培养4 h后换成完全培养基，转染成功的细胞命名为C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c；以转染pGenesil-1质粒为阴性对照(negative control, NC)组。细胞置于培养箱中用于后续实验。

2.3TaqMan real-time PCR实验 将转染的细胞以密度每孔1×106个接种到6 cm皿中，置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中，待细胞融合度达到90%时收集细胞，按照mirVana miRNA分离试剂盒提取细胞中的miRNA；运用TaqMan miRNA检测试剂盒检测miR-30c的表达，采用SYBR GreenⅡ荧光染料法和IQ5TMReal-Time PCR Detection System (Bio-Rad)进行real-time PCR数据分析，结果经U6 RNA内参照校正，miR-30c的相对表达量用2-ΔΔCt表示，进行3次独立重复实验。

2.4MTT法检测细胞活力 C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞及阴性对照细胞经消化计数后，以细胞密度为2.5×107/L接种于96孔板中，分别培养24 h、48 h、72 h和96 h时进行MTT实验，同时设空白对照组。每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃继续培养4 h，弃掉培养液，每孔加入150 μL DMSO，置于摇床上室温振荡5 min，用酶标仪测定492 nm处的吸光度(A)，按下式计算细胞活力抑制率：细胞活力抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/实验组A值×100%。

2.5集落形成实验 C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c及阴性对照细胞经胰酶消化计数后，以每皿500个接种于10 cm细胞培养皿中，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，每个剂量3个平行孔，培养直到通过肉眼能清晰观察到可见的细胞集落(约12 d)；将培养基倒掉，PBS洗涤，甲醇固定10 min，PBS洗涤，吉姆萨染色10 min，自来水清洗，晾干后计数，按下列公式计算细胞集落形成率：集落形成率(%)=细胞集落数平均值/铺板细胞数×100%。

2.6细胞迁移实验 C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞及阴性对照细胞经胰酶消化，然后在Transwells每个培养孔上室中加入2×104个细胞，下室为无血清培养基，设置空白对照组；37 ℃继续培养6 h后经4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，结晶紫染色，洗涤。用棉签轻轻擦去上室的贴壁细胞，在显微镜下拍照并计数从Transwell上室迁移至微孔膜下层的细胞，每组设3个重复孔，通过每组Transwell的迁移细胞数比较细胞的迁移能力。

2.7流式细胞术检测细胞凋亡 C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c、CaSki-miR-30c及阴性对照细胞以细胞密度每孔4×105个接种到6孔板中，培养72 h后弃掉培养基，PBS洗涤，用无EDTA的胰酶消化细胞，加入PBS制成细胞悬液。按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作，先加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，再加入5 μL FITC标记的Annexin-V和5 μL PI混匀，室温下避光孵育15 min，流式细胞术检测细胞凋亡。

2.8Western blot实验 C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c、CaSki-miR-30c及阴性对照细胞经消化、离心收集细胞，用RIPA裂解液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS)重悬细胞，超声破碎、12 000 r/min，4 ℃离心10 min，按照BCA试剂盒说明书测定总蛋白浓度。每个样本取30 μg进行SDS-PAGE，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别孵育 I 抗，以GAPDH为内参照，4 ℃过夜。TBST洗膜、孵育 II 抗，室温孵育1 h。ECL显影后扫描，蛋白相对表达量经内参校正后经Quanity One软件分析。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行相关数据分析。每个实验进行3次独立重复试验。结果用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-30c在宫颈癌细胞中过表达

TaqMan Real-time PCR结果显示，转染pGenesil-1-miR-30c的宫颈癌细胞中miR-30c的表达水平均显著增加，其中C33A、HeLa、SiHa及CaSki细胞中的miR-30c表达水平与对照组比较分别显著增加(P<0.01)，见图1。

Figure 1. The expression of miR-30c in the cervical cancer cells detected by TaqMan real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

图1TaqManreal-timePCR检测miR-30c在宫颈癌细胞中的表达水平

2 miR-30c过表达对宫颈癌细胞活力的影响

MTT实验结果显示，随着培养时间的延长，miR-30c过表达的宫颈癌细胞活力逐渐降低；24 h、48 h、72 h和96 h时C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞的活力均显著低于pGenesil-1细胞(P<0.05或P<0.01),表明miR-30c过表达能抑制宫颈癌细胞活力，见图2。

3 miR-30c过表达对宫颈癌细胞集落形成的影响

集落形成实验结果显示，miR-30c过表达可明显减少4种宫颈癌细胞的集落形成数,C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞的集落形成率与对照组细胞比较显著降低(P<0.01)，见图3。这一结果表明miR-30c过表达能抑制宫颈癌细胞的活性。

4 miR-30c过表达对宫颈癌细胞迁移的影响

Transwell结果发现，miR-30c过表达的宫颈癌细胞迁移数明显减少，C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞的迁移率与对照组细胞比较显著降低(P<0.01)，见图4。这一结果表明miR-30c过表达能抑制宫颈癌细胞的迁移。

5 miR-30c过表达对宫颈癌细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC染色及流式细胞术结果显示，miR-30c过表达的宫颈癌细胞凋亡率明显增加，C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞凋亡率与对照组细胞比较显著升高(P<0.05)，见图5。这提示miR-30c过表达激活细胞凋亡通路，诱导细胞凋亡。

6 miR-30c过表达对细胞凋亡信号通路相关分子表达的影响

Western blot结果发现，与对照组相比，C33A-miR-30c、HeLa-miR-30c、SiHa-miR-30c和CaSki-miR-30c细胞中Bax蛋白表达明显增加，而Bcl-2的表达水平降低，差异具有统计学意义(P<0.01),见图6。

Figure 2. The effect of miR-30c over-expression on the viability of cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC group.

图2miR-30c过表达对宫颈癌细胞活力的影响

Figure 3. The effect of miR-30c over-expression on the colony formation ability of the cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

图3miR-30c过表达对宫颈癌细胞集落形成的影响

Figure 4 The effect of miR-30c over-expression on the migration ability of the cervical cancer cells (crystal violet staining, ×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

图4miR-30c过表达对宫颈癌细胞迁移能力的影响

Figure 5. The effect of miR-30c over-expression on the apoptosis of cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

图5miR-30c过表达对宫颈癌细胞凋亡的影响

Figure 6. The effect of miR-30c over-expression on protein expression of the apoptosis signaling pathway-related molecules in the cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vspGenesil-1 group.

图6miR-30c过表达对宫颈癌细胞凋亡信号通路相关蛋白表达的影响

7 miR-30c过表达对细胞迁移相关蛋白表达水平的影响

Western blot结果发现，miR-30c过表达的宫颈癌细胞中MMP-13蛋白表达量显著降低，而TIMP-1蛋白显著增加(P<0.01)；相同条件下MMP-9蛋白表达量变化的差异无统计学显著性,见图7。这一结果提示miR-30c过表达通过调控靶基因的表达而抑制宫颈癌细胞的表型。

讨 论

宫颈癌的发病率随着年龄的增长而逐渐升高，一般在50～60岁达到高峰。据统计，中国每年约有18万新增病例[14]。目前无特异性治疗宫颈癌的靶向药物，宫颈癌发病机制仍不清楚，因此，揭示宫颈癌发病机制、研发宫颈癌靶向治疗药物迫在眉睫。大量研究发现miRNA在细胞的增殖、分化、衰老以及凋亡中具有重要作用，miRNA的异常表达与肿瘤的发生发展以及肿瘤细胞放/化疗耐受密切相关[15-17]。因此，miRNA是肿瘤靶向小分子药物的潜在靶点。目前，以miRNA-34为靶点的原发性肝癌靶向药物NCT01829971和以miR-122为靶点的丙型肝炎靶向药物NCT01872936正在进行临床I期和II期试验[18-19]。miR-30c是最新发现的miR-30家族成员，其生物学功能仍不清楚。研究发现miR-30c过表达抑制乳腺癌细胞的增殖[9]；而下调miR-30c的表达可维持乳腺肿瘤干细胞的自我更新和细胞凋亡功能[10]；近新的研究发现，上调miR-30c表达可抑制卵巢癌的增殖、迁移和侵袭[11]。相反，Goparaju等[12]发现miR-30c过表达促进肺癌细胞上皮间质转化从而增强细胞对吉非替尼的耐受；研究发现上调miR-30b/c的表达能抑制胶质瘤细胞调亡[13]。本研究发现miR-30c过表达显著抑制宫颈癌细胞的增殖、克隆形成能力以及迁移率，与文献[9-11]报道结果类似，提示miR-30c是一种肿瘤抑制因子参与宫颈癌的发生和发展。

目前，宫颈癌的发病机制仍不清楚，研究显示原癌基因的激活、抑癌基因的失活与宫颈癌形成的分子机制密切相关[20]。本研究发现miR-30c过表达的宫颈癌细胞的凋亡率明显增加，表明miR-30c具有诱导细胞凋亡的功能。我们进一步探讨miR-30c过表达是否激活细胞凋亡通路。Bcl-2家族是细胞凋亡通路重要的调节子，早期的研究发现Bcl-2家族中的促凋亡蛋白(Bax、Bak和Bim)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)参与了线粒体介导的细胞凋亡过程[21]。我们的研究显发现在宫颈癌细胞中miR-30c过表达Bax蛋白水平增加，而Bcl-2蛋白水平降低，提示miR-30c过表达促进促凋亡蛋白Bax的表达和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，细胞凋亡通路被激活，诱导宫颈癌细胞凋亡。我们的研究也发现，miR-30c过表达显著抑制宫颈癌细胞的迁移。MMP活性在肿瘤细胞转移过程中发挥关键作用[22]，MMP家族成员的表达水平与恶性肿瘤的高转移活性密切相关[23]。已有研究发现，MMP-13过表达能促进乳腺癌的增殖和转移[24]。于是我们推测miR-30c过表达可能通过调控MMP和TIMP的表达而抑制宫颈癌细胞的转移，结果显示miR-30c过表达明显抑制MMP-13的表达，而促进TIMP-1表达，但对MMP-9表达无影响，提示miR-30c过表达可能通过抑制MMP-13的表达而抑制宫颈癌细胞转移。

Figure 7. The effect of miR-30c over-expression on the expression levels of target genes in the cervical cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspGenesil-1 group.

图7miR-30c过表达对靶基因表达的影响

本研究结果表明，miR-30c过表达抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移以及诱导细胞凋亡，其机制可能与激活细胞凋亡通路、调控MMP家族成员的表达水平有关。本研究为以miR-30c为靶点研发治疗宫颈癌的靶向药物提供科学依据。

[参 考 文 献]

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