ABCA7遗传变异调节中国北方人群LOAD风险的关联研究

张俊荣 王少为 杨 泽

阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一,它包括早发型AD和晚发型AD(LOAD)[1～3]。根据以往的研究，95%的AD患者为晚发型AD[4，5]。LOAD的标志是淀粉样β(Aβ)在脑实质和脑血管中的沉积,伴随进行性认知下降。LOAD发生的详细病因尚不明确，已知遗传和环境因素共同起着重要的作用。ApoEε4等位基因,是唯一一个无可争辩的遗传因素[6，7]，除了年龄增长之外，环境风险因素包括吸烟、酒精、肥胖、高血压、血脂异常、糖尿病和心血管疾病等都可能导致LOAD[8，9]。全基因组关联研究识别到ATP结合转运A7(ABCA7)作为LOAD的易感性位点，与LOAD相关的ABCA7单核苷酸多态性(SNPs)调节了LOAD发生的风险[10～15]。

ABCA7是ATP结合转运家族的成员,主要参与脂质运输和稳态。其高度同源的家族成员ABCA1通过参与胆固醇代谢和加工淀粉样蛋白前体蛋白质与LOAD的发病相关[5～7]。ABCA7的过度表达导致Aβ显著减少[8]。因此，ABCA7通过改变ATP的转运直接影响淀粉样蛋白的病理学。虽然，ABCA7在LOAD的发病机制中起着关键作用，但在不同人群中存在差异，作为北方人群LOAD的危险因素ABCA7遗传变异并不明确。此外,北方人群是中国代表性的人群，为了检测受试者的遗传风险关联,我们研究了ABCA7的6个SNPs,以评估这些SNPs与LOAD在ABCA7遗传分析中的相关性。

1.研究对象与方法

1.1 研究对象 晚发性阿尔茨海默病患者是从北京医院门诊和门诊部招募的。对照是经过临床排除有任何脑部疾患和精神症状的一般人群。年龄和性别结构如表1，两组分布差异无统计学意义，P>0.05，具有可比性。

表1 LOAD患者和对照组特征的比较

1.2 入组标准 ①符合根据阿尔茨海默病协会的标准诊断的可能的阿尔茨海默病;②符合《精神疾病诊断和统计手册》第四版(DSM IV)诊断轻度或中度阿尔茨海默病;③发病年龄为65岁或以上;④Hachinski缺血分级评分<4。

1.3 排除标准 如果患者符合以下任何标准,则排除:①目前或过去诊断有其他神经系统疾病(如中风、帕金森病、外伤性脑损伤);②目前或过去诊断有精神疾病(如精神分裂症、谵妄、主要抑郁障碍、幻觉、酒精或物质依赖性和/或误用);③当前或过去诊断有代谢紊乱(如糖尿病、高血压);④没有可靠的照顾者能为神经心理学和行为评估提供可靠的信息。

本项研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则，获得北京医院伦理委员会批准。在参与研究之前,所有患者或监护人均获得书面的知情同意。

1.4 基因检测 所有基因型都是用Sanger方法检测。ABCA7和ApoE多态性站点的信息来自国家生物技术信息中心建立的单核苷酸多态性数据库。

1.5 评价方法 简易智力状态检查(MMSE,1993)和临床痴呆评分表(CDR,1982)被用来评估患者的认知功能。

1.5.1 简易智力状态检查：可能的总得分在MMSE范围从0分(最严重)到30分(正常)。MMSE总分应考虑参加者的教育(如17为文盲,20为小学毕业生,24为中学毕业生或高等教育)。较高的MMSE评分表明阿尔茨海默病患者具有更好的认知功能。利用从基线到终点的MMSE总分的变化,确定患者认知能力下降的程度。

1.5.2 CDR评分分为5个点：CDR-0表明没有认知障碍,其余4点表示LOAD的不同阶段:CDR-0.5,非常轻度的LOAD;CDR-1,轻度LOAD;CDR-2,中度LOAD;CDR-3,重度LOAD。从基线到终点的CDR评分的增加用于确定患者认知障碍的进展。认知障碍的进展定义为增加一个点以上患者的总CDR评分。由两名训练有素的神经科医师通过访谈患者或其可靠的看护者,完成MMSE和CDR的评估。

1.6 统计学方法 利用基因型数据对ABCA7的6种基因多态性进行检测，①基于χ2的哈德-温伯格平衡(HWE)检验,用于检测基因分型误差;②SNPs病例对照研究采用卡方(χ2)试验;③计算连锁不平衡(LD’和r2)；④估算的单倍型块；⑤以Haploview(http://www.broadinstitute.org/haploview/)推断各单倍型块并开展病例对照单倍型分析。为了评价这些遗传变异和环境因素对LOAD发生风险的影响,进行了多元逻辑回归分析。疾病的相对风险，OR值与95%的可信区间(CI)的计算以2×2列联表。上述统计分析使用SPSS 22.0软件。在SNPs的病例对照研究中，多元回归分析显示遗传因素和环境因素对SNPs同时产生影响。计算SNPs与年龄、性别及ApoEε4等位基因的OR值及95%CI的关联。当P<0.05时，差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 研究对象的人群和临床特点 300例LOAD患者和508例健康对照者参与了病例对照研究。HWE检验表明，ABCA7多态性的等位基因频率分布无显著偏离(rs3764650：P=0.43,rs2276412：P=0.83,rs3752246：P=0.43,rs74642146：P=0.91)，但rs115550680(P=0.004)和rs17125548(P=NA)显著偏离。

2.2 LOAD患者中SNPs的基因型、等位基因频率、遗传模型及LOAD的风险分析 LOAD患者的6种ABCA7SNPs和对照组中的基因型和等位基因频率，结果表明,两组的等位基因分布有显著差异rs3752246，P=0.01,OR(95%CI)=1.318(1.05-1.64)；rs3764650，P=0.002,OR(95%CI)=1.38(1.12-1.70)。此外,在LOAD患者中，rs3752246TT基因型样本(P=0.04)和rs3764650T T基因型样本(P=0.006)有显著性关联。

在病例对照组，rs3764650 T等位基因显示有显性效应[P=0.006,OR(95%CI)=1.75(1.17-2.62)],rs3764650TT基因型[P=0.02,OR(95%CI)=1.45(1.06-1.97)]对LOAD风险的调节也显示有显著效果。rs3752246的C等位基因[P=0.041,或(95%CI)=1.359(1.021-1.809)]病例对照组比较显示有显著性关联。

2.3 LOAD与ApoEε4等位基因携带者、年龄和性别的相关性 对ApoEε4等位基因状态的分层分析表明,在rs3764650的研究对象中不存在明显的差异。在无ApoEε4等位基因的LOAD患者中，ABCA7 rs3764650 T等位基因出现较高频率,与对照组比较OR=1.85,95%CI=(1.18-2.92),P=0.008。此外,年龄和性别分层分析进一步揭示,ABCA7 SNP rs3752246的“T”等位基因与LOAD风险显著相关，尤其是rs3764650的“T”等位基因调节了男性患者与LOAD风险显著相关[P=0.04；OR(95%CI)=1.87(1.03-3.43)]，并且rs3752246“T”等位基因与女性患者的LOAD风险极大的显著相关[P=10-8,OR(95%CI)=19.81(7.60-51.62)]

2.4 LD结构和单倍型分析ABCA7 SNPs图谱显示，北方人群有2个LD基因区块。一个LD块由rs3752246和rs3764650组成,位于ABCA7的5’区域,另一个包括两个SNPs(rs115550680和rs2276412)。单倍型分析分别在两个LD块中进行,我们的研究发现TC单倍型[P=1.29×10-7,或OR(95%CI)=15.138(3.996-57.341)]与增加LOAD风险相关。CC单倍型[P=5.99×10-6,OR(95%CI)=0.549(0.422-0.712)]在病例和对照组之间起到减少LOAD风险的作用。

3.讨论

先前的研究结果显示,ABCA7基因内的基因变异与中国人群的AD易感性有显著的相关性。因为中国人群多样性的特点，所以有必要利用ABCA7基因中的遗传变异来识别特定中国地区人群的LOAD易感性。据我们所知,这是第一个评估ABCA7变异改变了北方人群的LOAD风险的研究。

这可能是由于在相关的SNPs标记的致病变异频率上的人群差异(ABCA7 rs115550680在非西班牙裔白人是单一形态;rs3752246的小等位基因在中国人群中是0.04，在非西班牙裔白人是0.19;rs3764650的小等位基因中国人群是0.25,非西班牙裔白人是0.11),或者是新确定的等位基因对疾病估计效果的偏倚。

然而,在ABCA7的影响大小上,白人和中国人在被诊断为LOAD的相对概率上存在有大的差异，也有可能是由对蛋白质的结构或功能有影响的种群特异性致病变异导致的。rs115550680位于多个内含子和外显子之间的连锁不平衡块,这意味着rs115550680的变异可能导致的不平衡。因此,尽管这项研究的结果很好，仍需要在另外的独立样本人群中复制,并有足够的力度可以检测小概率事件并进行功能性确认,以前在白人和非洲裔美国人的研究中ABCA7是阿尔茨海默病的危险因子的结论[3,5]也支持我们的研究结果。

结果表明,在北方人群中ABCA7 rs3752246的等位基因和基因型分布与无ApoE ε4的LOAD和对照组的rs3764650多态性存在显著差异。这表明,rs3752246和rs3764650的“T”等位基因可能是中国北方人群LOAD的危险因素。在ApoE ε4携带者、年龄和性别之间分别进行了分层分析,发现LOAD患者ApoE ε4非携带者在 rs3764650 和 rs3752246 之间的增加趋势。在这个人群中,ABCA7可能优于ApoEε4。三因素混合和年龄、性别的差异可导致结果偏倚。

我们研究发现,有性别特异特征的LOAD患者与SNP rs3764650和rs3752246相关联。我们检测到rs3752246多态性是女性轻度认知功能障碍LOAD患者的关联位点。在检查LOAD患者的rs3764650，我们也发现该位点对男性的影响,这也支持以前的ABCA7是AD患者一个性别特定的遗传危险因素。2017年欧洲人的研究表明,除了没有证据显示干扰ABCA7功能和携带ApoEε4等位基因之间的协同作用之外,还有独立的性别因素，这也支持我们的研究。

可见,rs3764650的显性和隐性模型均有明显差异,rs3752246的基因型TT+CT在病例对照组中表现不显著,但仍有趋势具有显性效应,推断出未来的研究样本量可以进一步扩大。

对于单倍型分析,我们识别到rs3764650和rs3752246与一个区块的不平衡密切相关;即单倍型CC和TC,这与LOAD显著相关。rs3764650位于基因的5’端,我们可以看到rs3752246是位于它旁边并存在连锁不平衡结构。rs3764650的基因多态性位于ABCA7基因的内含子区域,因此不影响氨基酸序列或蛋白质结构。但我们仍然可以推测,内含子突变可能会影响mRNA,改变内含子内的小分子,如增强子,然后影响转录。此外,rs3752246是ABCA7的同义变异。我们不能否认同义突变的作用,它可能影响转录因子结合的稳定性,进而影响ABCA7的功能。这两个变异聚集在ABCA7基因5’端可能影响ABCA7编码蛋白的功能。

据我们所知，在北方人群中,没有关于LOAD敏感性位点的数据。目前的研究有局限性，我们的病例对照研究规模较小,这可能影响了结果的稳定性。病例对照组的年龄范围和性别不匹配也是本研究的局限性。由于研究样本的限制,rs3764650和rs3752246的意义与LOAD的关联性估计是不足的,在大队列研究中可以定量地比较。然而，我们的结果仍然提供了一些证据证明ABCA7与LOAD有关。此研究中我们已经发现了LOAD在特定的北方人群和ABCA7的关联。总的来说，ABCA7遗传变异(rs3752246和rs3764650)可以调节北方人群LOAD的风险,具有潜在的临床应用价值。

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