结直肠癌组织间隙连接蛋白29表达变化及其与患者临床病理参数的关系

张永盟，张姗姗，袁明，赵卫星，鲍永华，杨万才

(1 新乡医学院基础医学院，河南新乡453003；2 济宁医学院精准医学研究院)

细胞间隙连接是普遍存在于细胞间的膜通道结构，由相邻细胞膜上的两个连接子相互连接而成。每个连接子由6个相同的连接蛋白亚单位构成，每个亚单位即为细胞间隙连接蛋白(Cx)。Cx是一类同源四次跨膜结构蛋白家族，具有传递细胞信息、协调新陈代谢、控制细胞增殖和分化以及维持内环境稳定等多种生理功能[1]；其功能在不同的器官或组织具有特异性。Cx29是Cx家族成员之一，我们通过对大数据统计分析发现，其可能与结直肠癌的发生、发展有一定相关性，但具体机制尚不清楚。本研究观察了结直肠癌组织Cx29表达变化，现分析其与患者临床病理参数的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选择济宁医学院精准医学研究院标本库收集的2012～2014年结直肠组织蜡块标本48例份，其中43例份包含结直肠癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结组织，5例份包含结直肠癌组织和癌旁正常组织。标本来源患者男22例、女26例，年龄39～85岁、中位年龄68岁，结肠癌22例、直肠癌26例；肿瘤形态：隆起型5例，溃疡型41例，浸润型2例；浸润深度：未浸透浆膜层20例，浸透浆膜层28例；组织分化程度：高中分化38例，低未分化10例；有淋巴结转移43例，无淋巴结转移5例。

1.2 Cx29表达检测

1.2.1 组织芯片构建 将48例份组织蜡块切成厚度为4 μm切片。切片经60 ℃烘箱烤片1 h，行HE染色。显微镜下标出每张切片对应的结直肠癌组织、癌旁正常组织或转移淋巴结组织，同时在蜡块上圈出其对应位置。将组织蜡块送武汉谷歌生物科技有限公司制成组织芯片蜡块，然后对其切片，再将切片转移至载玻片上制成组织芯片。为方便统计分析，将同一患者结直肠癌组织、癌旁正常组织或转移淋巴结组织依次标记位置。

1.2.2 免疫组化染色 采用SABC法。将上述制作的组织芯片于60 ℃烘箱中烤片1 h，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡水化，蒸锅中加热0.01 mol枸橼酸钠缓冲液至95 ℃左右，放入组织芯片加热5 min进行抗原热修复，自然冷却至室温；PBS漂洗5 min×3次，滴加3%过氧化氢室温孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，山羊血清室温封闭30 min，加入兔抗人Cx29单克隆抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜；取出保湿盒晾至室温，PBS漂洗5 min×3次，加入生物素标记的山羊抗兔二抗(1∶200)室温孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，加入SABC室温孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB显色，苏木素复染，PBS返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。免疫组化染色过程中癌旁正常组织6例份、转移淋巴结组织2例份丢失，共获取结直肠癌组织48例份、癌旁正常组织42例份、转移淋巴结组织41例份。

1.2.3 Cx29表达判定 Cx29阳性染色定位于细胞膜和细胞质，呈淡黄色、黄色或棕褐色。根据染色强度对Cx29表达进行判定：淡黄色为1分，低表达；黄色为2分，中表达；棕褐色为3分，高表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织、癌旁正常组织和转移淋巴结组织Cx29表达比较 见表1。

表1 不同组织类型Cx29表达比较[例(%)]

注：与癌旁正常组织比较，*P<0.05。

2.2 结直肠癌组织Cx29表达与患者临床病理参数的关系 见表2。

表2 结直肠癌组织Cx29表达与患者临床病理参数的关系

3 讨论

结直肠癌是最常见的、严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。据2015年中国癌症统计数据显示，我国结直肠癌的发病率和病死率均居所有恶性肿瘤的第五位[2]。随着经济的发展，人们生活方式以及饮食结构的改变，结直肠癌的发病率和病死率均有显著上升趋势。肿瘤形成是一个长期的过程，需要经历多个阶段，涉及多种基因。近年来通过人类基因组计划研究了解人类基因组后，能够从基因水平上认识疾病，继而从根本上治疗或预防人类疾病。故肿瘤发生、发展的分子机制及靶向治疗备受关注。为了提高结直肠癌患者的临床治疗效果和生存期，探寻特异的分子靶标指导临床决策就显得尤为重要。

Cx几乎存在于哺乳动物的所有组织和细胞中，现已知其家族中至少有21位成员，其基因序列具有高度同源性，通常以不同的组合方式或不同的组合存在于不同组织和细胞中[3]。有研究发现，6个多方形的Cx组成1个半通道，2个半通道相互对接形成1个亲水性孔道；而形成的半通道可以是相同的，也可以是不同的，2个半通道对接到一起，形成相同的通道(同质连接)或不同的通道(异质连接)[4]。这些通道能直接参与细胞内外信息传递，如细胞内代谢产物、第二信使以及电信号等[5]。目前已证实，在肿瘤和转化细胞中普遍存在细胞间隙连接功能缺陷和Cx表达异常。Cx在内质网膜上可聚集合成功能型六聚连接小体[6]。亚细胞分离研究和免疫定位研究表明，Cx通过高尔基体到达细胞膜[7～9]。除此之外，Cx在内质网合成，高尔基体加工修饰后进入细胞质中，经转运小体到达细胞膜[10]。目前关于Cx家族成员Cx26、Cx32、Cx43等与肿瘤的关系已有较深入研究[11]。Cx43在前列腺癌进展的不同时期作用不同，前列腺癌早期Cx43表达缺失可促进肿瘤进展，而在晚期骨转移过程中Cx43表达可增强肿瘤细胞的侵袭力和附着力，这种现象在体内外实验均得到验证[12]。在乳腺癌中同样发现Cx43表达可促进肿瘤细胞迁移[13]。而在肝细胞癌中Cx32可通过Snail介导的EMT信号通路来抑制肝癌细胞侵袭[14]。现已证实，Cx43与结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌的发生、发展和患者预后有关[15～19]。Cx29定位于人类染色体7q22.1，由279个氨基酸组成，分子量为31.299 kD。有研究发现，Cx29基因突变可导致Cx在细胞质内质网中表达增高，从而促进非综合征型耳聋的发生[20]。亦有报道，Cx29蛋白并没有形成功能性间隙蛋白通道，而是增强HeLa细胞中能量释放[21]。但Cx29与肿瘤的关系，特别是与结直肠癌发生、发展的关系，国内外鲜见报道。

本研究结果发现，结直肠癌组织及转移淋巴结组织Cx29高表达明显高于癌旁正常组织，结直肠癌组织Cx29高表达与肿瘤组织分化程度有关，提示Cx29高表达可能促进结直肠癌的发生、发展。本研究同期分析了人类蛋白图谱数据库、美国癌症基因图谱TCGA中438例结直肠癌患者临床资料，其中Cx29低表达者138例、Cx29高表达者300例，在长达12年的随访中，Cx29高表达者生存时间明显短于Cx29低表达者，说明Cx29表达变化有可能作为结直肠癌患者预后判断的生物学标志物。但由于本研究未对患者进行随访观察，这个结论尚需进一步验证。

综上所述，结直肠癌组织Cx29高表达，其表达变化与肿瘤组织分化程度有关。但目前对Cx29的具体作用机制尚不清楚，今后还需要进一步深入研究。

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