银屑病患者外周血滤泡辅助性T细胞比例、血清IL-21水平变化及其与病情的关系

吕萌，沈萃萃

(广州中医药大学临床医学院，广州510405)

银屑病是一种自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明确，可能与遗传、内分泌、免疫功能异常及微循环障碍等有关[1，2]。滤泡辅助性T细胞(Tfh)是近年发现的CD4+T细胞亚群[3,4]，已被证实可参与自身免疫性疾病的发生。Tfh主要以膜表面表达CXC趋化因子受体5(CXCR5)以及诱导共刺激分子(ICOS)表达等为特征[5]。CXCR5是Tfh区别于其他CD4+T细胞的标志，ICOS表达在活化Tfh细胞中。Tfh可分泌IL-21[6]，但血清IL-21并不全是由Tfh分泌，辅助性T细胞17(Th17)也能分泌IL-21。本研究观察了银屑病患者外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平变化，并探讨其在银屑病发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年10月～2017年2月广州中医药大学第一附属医院收治的银屑病患者77例(观察组)，男44例、女33例，年龄33～62(44.2±5.3)岁，银屑病皮损面积与严重程度评分(PASI评分)[7](总分72分，得分越高，病情越重)≥10分42例、<10分35例。所有患者符合赵辩主编《临床皮肤病学》[8]中的相关诊断标准。排除自身免疫系统疾病、感染性疾病以及其他慢性疾病者，入院前30天内接受过可能会影响免疫功能的药物治疗者，合并恶性肿瘤者。另选同期在广州中医药大学第一附属医院接受体检的健康者70例(对照组)，男41例、女29例，年龄32～63(44.4±5.5)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经广州中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 外周血Tfh(CD4+CXCR5+T细胞)、活化Tfh(CD4+CXCR5+ICOS+T细胞)及Th17比例检测 所有研究对象(观察组入院次日)采集清晨空腹静脉血6 mL，均分为2份，取任意一份EDTA抗凝，与等体积的PBS混匀，加入Ficoll淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞；将单个核细胞保存在含有10%胎牛血清的二甲基亚砜培养液中。用PBS重悬上述细胞，分别加入CD45-PC7、CD3-ECD、CD4-FITC、CXCR5-PC以及ICOS-PE抗体各20 μL，充分震荡后置于阴暗处孵育20 min。滴加PBS 2 mL，离心后去除上清液，重复洗涤2次；滴加PBS 500 μL重悬，流式细胞仪检测CD4+CXCR5+T细胞、CD4+CXCR5+ICOS+T细胞。采用RPMI 1640培养液调整上述单个核细胞密度为8.0×105个/mL，随后将细胞悬液接种于6孔板中，加入50 ng/mL的佛波酯、500 ng/mL离子霉素、1 mmol/L布雷非德菌素A，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h，加入CD45-PC7、CD3-ECD、CD8-PE各20 μL，室温避光条件下孵育20 min，PBS重复洗涤2次，离心处理去除上清液；固定剂固定15 min，PBS洗涤1次，离心处理去除上清液；加入破膜剂在室温下孵育5 min，离心处理去除上清液；加入IL-17抗体，室温避光条件下孵育20 min，离心处理去除上清液；加入PBS 500 μL重悬，上流式细胞仪检测Th17。

1.3 血清IL-21检测 取另一份空腹静脉血标本，分离血清后采用ELISA法检测血清IL-21。严格按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 两组外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比较 观察组外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平均高于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2 观察组PASI评分≥10分者与<10分者外周血Tfh、活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比较 观察组PASI评分≥10分者外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平均高于PASI评分<10分者(P均<0.05)，但二者外周血Tfh、Th17比例比较P均>0.05。见表2。

表2 观察组PASI评分≥10分者与<10分者外周血Tfh、 活化Tfh、Th17比例及血清IL-21水平比较

注：与PASI评分<10分者比较，*P<0.05。

3 讨论

研究认为，免疫功能异常可参与银屑病发生、发展[9,10]。Tfh是一种功能强大的T细胞亚群，是CD4+效应T细胞的一个亚群，因其表达CXCR5和IL-21等，故可存在于淋巴滤泡中并辅助B细胞活化和分化。IL-21为Tfh分泌的主要细胞因子，也是其最主要的效应执行分子。目前主要通过检测T细胞表面CXCR5和ICOS蛋白的方法来确定Tfh。外周血Tfh比例在多种自身免疫性疾病患者(如系统性红斑狼疮)中升高，故笔者推测Tfh细胞可能参与银屑病的发生、发展。国内外多项研究报道，自身免疫性疾病患者外周血Tfh比例明显升高，且其升高程度和致病性抗体水平呈正相关关系，提示外周血Tfh可参与自身免疫性疾病的发生。本研究结果显示，观察组外周血Tfh、活化Tfh比例均明显高于对照组。表明外周血Tfh在银屑病的发生、发展过程中具有至关重要的作用。薛国辉等[11，12]报道，银屑病患者外周血Tfh比例升高，本研究结果与之相符。表明外周血Tfh在银屑病的发生、发展过程中具有重要作用。观察组外周血Th17比例明显高于对照组，表明Th17细胞也可能参与了银屑病的发生、发展过程，与文献[13～16]报道相符。观察组血清IL-21水平明显高于对照组，表明IL-21作为Thf的效应分子参与银屑病的发生、发展。

本研究结果显示，观察组PASI评分≥10分者外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平均明显高于PASI评分<10分者，表明检测外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平有助于患者病情判断。Tfh细胞可自分泌或旁分泌IL-21，Th17也可分泌IL-21。综合本研究结果，笔者认为观察组血清IL-21水平高于对照组是由于活化Tfh比例升高而不是由于Th17分泌增多所致。表达ICOS的活化Tfh可能是在银屑病发病过程中起致病作用的主要效应细胞，其可严重影响Tfh的存活状态，同时对Tfh分泌IL-21的能力进行调控。因此认为，活化Tfh可能是通过调控IL-21的分泌而参与银屑病的发生、发展。活化Tfh可调控IL-21的分泌，影响外周血IL-21水平，继而影响炎症反应过程，导致银屑病的发生、发展。

综上所述，检测外周血活化Tfh比例及血清IL-21水平有助于辅助评估银屑病患者病情。

参考文献：

[1] Deng J, Yao D, Lu C, et al. Oral Chinese herbal medicine for psoriasis vulgaris: protocol for a randomised, double-blind, double-dummy, multicentre clinical trial[J]. BMJ Open, 2017,7(11):14475-14476.

[2] 樊超,向华国,陈宏翔,等.红斑型银屑病患者他克莫司治疗前后IL-17A、IL-22和IL-6的变化分析[J].医学分子生物学杂志,2016,13(5):276-280.

[3] Sawatsubashi S.Update on recent progress in vitamin D research. Vitamin D in the treatment of psoriasis[J]. Clin Calcium, 2017,27(11):1629-1635.

[4] 王洁,徐蓉,李斌,等.加味芩珠凉血方联合他扎罗汀凝胶治疗血热证寻常型银屑病的疗效观察[J].上海交通大学学报(医学版),2016,36(11):1610-1612.

[5] 雷田兵,罗模桂,刘官智,等.阿维A联合窄谱中波紫外线治疗寻常性银屑病的疗效及其对患者外周血细胞因子IFN-γ、IL-4及IL-17的影响[J].海南医学,2016,27(13):2118-2120.

[6] 叶柱均,叶耀佳,叶锦波,等.寻常型银屑病患者血清IL-17、IL-22水平检测及其与病情相关性探讨[J].中国医药科学,2016,6(12):216-218.

[7] 杨璐,郑擎,任雅君,等.卡介菌多糖核酸联合紫外线光疗对银屑病患者细胞免疫功能影响[J].浙江医学,2017,39(7):512-514.

[8] 叶柱均,叶淑霞,陈丽仙,等.IL-17、IL-22和CRP在银屑病患者血清中的表达[J].国际检验医学杂志,2016,31(2):254-255.

[9] 吴丽兴,陈长镜,罗军敏,等.Th17细胞及其相关因子在银屑病发病中的作用及其分子机制[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(2):282-284.

[10] 汤雯剑,罗浩,赵金涛,等.银屑病患者血清中IL-10与IL-21水平监测的临床应用[J].现代检验医学杂志,2015,30(2):65-67.

[11] 薛国辉,华琳,刘晓峰,等.外周血循环滤泡辅助性T细胞及IL-21在银屑病中的表达及意义[J].中国免疫学杂志,2016,32(11):1645-1648.

[12] 王晓琴,慕珍珍,韩秀萍,等.CCL20、CCR6及IL-17A在寻常型银屑病患者血清中的表达及意义[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2017,16(2):122-124.

[13] 房武宁.寻常型银屑病患者血清IL-21及IL-31的表达及临床意义[J].现代中西医结合杂志,2016,25(12):1297-1299.

[14] 刘秀卿,李卓成,吴文中,等.雷公藤多苷对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠Wnt/Frizzled信号传导通路的影响[J].海南医学院学报,2016,22(11):1044-1047.

[15] Shin D, Kim DS, Kim SH, et al. Decreased PD-1 positive blood follicular helper T cells in patients with psoriasis[J]. Arch Dermatol Res, 2016,308(8):593-599.

[16] Niu J, Song Z, Yang X, et al. Increased circulating follicular helper T cells and activated B cells correlate with disease severity in patients with psoriasis[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol, 2015,29(9):1791-1796.