散发性结直肠癌组织MMR蛋白表达变化及其与患者临床病理参数和预后的关系

宋蒨，石红建，任景丽，黄优华，徐强，孙钟武，张中平

(1 江苏大学附属武进医院，江苏常州213002；2 郑州大学第二附属医院)

据统计，约95%结直肠癌为散发性结直肠癌(SCC)[1,2]，而15% SCC是由错配修复基因(MMR)蛋白表达缺失引起的[3]。目前在人体内发现的MMR有9种，即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6，其作用主要是识别错配位点并予以纠正，以保证DNA复制的准确性。如MMR发生突变，将引起机体错配修复功能缺失，导致整个基因组不稳定，从而使某些癌基因或突变的抑癌基因快速聚集，继而形成肿瘤[4]。在MMR中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突变约占MMR突变的90%以上[5，6]。本研究观察了SCC组织MMR蛋白表达变化，现分析其表达变化与患者临床病理参数和预后的关系。

1 临床资料

1.1 基本资料 研究对象为2009年6月～2012年6月在江苏大学附属武进医院行手术治疗的SCC患者180例，均经术后组织病理检查明确诊断。患者男98例、女82例，年龄60～86(70.89±8.13)岁；肿瘤直径：≥5 cm 76例，<5 cm 104例；肿瘤形态：溃疡型95例，隆起型47例，浸润型38例；肿瘤部位：右半结肠106例，左半结肠或直肠74例；病理类型：腺癌136例，黏液腺癌或其他类型44例；TNM分期[7]：Ⅱ期86例，Ⅲ期94例；组织分化程度：高分化68例，中低分化112例；有淋巴结转移94例，无淋巴结转移86例。术后每3个月随访1次，随访方式包括门诊及住院复查、电话随访等。随访截至2017年6月，中位随访时间60个月，死亡68例。

1.2 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

1.3 SCC组织hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达检测 取手术切除的SCC组织，采用免疫组化法检测hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达。以正常结直肠黏膜上皮作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：MMR蛋白定位于细胞核，以细胞核出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞。随机选取5个200倍视野，每个视野计数100个细胞，计算阳性细胞所占比例。根据染色强度和阳性细胞所占比例综合判断MMR蛋白表达。染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞所占比例：无阳性细胞为0分，≤10%为1分，>10%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分。两项评分的乘积>3分为MMR蛋白表达正常，≤3分为MMR蛋白表达缺失。hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白均正常表达为正常表达(pMMR)，至少一项蛋白表达缺失即为阴性表达(dMMR)。本组MMR蛋白表达缺失29例，表达缺失率为16.1%。其中hMLH1蛋白表达缺失19例，hMSH2蛋白表达缺失13例，hMSH6蛋白表达缺失10例；仅hMLH1蛋白表达缺失11例，仅hMSH2蛋白表达缺失4例，仅hMSH6蛋白表达缺失3例，hMLH1、hMSH2蛋白表达均缺失4例，hMSH2、hMSH6蛋白表达均缺失3例，hMLH1、hMSH6蛋白表达均缺失2例，hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表达均缺失2例。本组pMMR 29例，dMMR151例。

1.4 SCC组织MMR蛋白表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 SCC组织MMR蛋白表达与患者临床病理参数的关系(例)

1.5 不同MMR表达者5年无病生存率及5年总生存率比较 采用Kaplan-Meier法绘制生存时间曲线，经Log-rank检验，dMMR者与pMMR者5年无病生存率分别为75.9%(22/29)、43.7%(66/151)，5年总生存率分别为82.8%(24/29)、58.3%(88/151)，两者比较差异均有统计学意义(χ2分别为10.872、6.044，P均<0.01)。见图1、2。

2 讨论

1993年Lothe等[8]发现了一条新的可导致SCC途径——MMR途径。MMR蛋白的主要功能是保证基因复制的精确性，在DNA复制过程中出现碱基错配时，MMR识别并予以修复，以保证基因组稳定性。如MMR发生突变，将引起错配修复功能缺失，导致整个基因组不稳定，从而使某些癌基因或突变的抑癌基因快速聚集，继而形成肿瘤[4]。

图1 不同MMR表达SCC患者无病生存时间曲线

图2 不同MMR表达SCC患者总生存时间曲线

目前已在人体内发现了9种MMR蛋白，任意一个MMR蛋白表达缺失，均会导致MMR系统功能缺失。在MMR突变中，hMLH1、hMSH2、hMSH6突变超过90%。hMLH1、hMSH2、hMSH6多形成异源二聚体发挥作用，可特异性识别核苷酸链上的错配位点，并进行切除、修复。hMLH1蛋白在错配修复过程中主要参与核酸内切酶激活，在切开碱基及解除双螺旋过程中发挥重要作用，并参与合成新的核苷酸链；还可与hPMS1形成Mutlα，纠正错误插入的碱基。hMSH2是最早发现的MMR蛋白，其表达于所有正常结直肠黏膜，通过与hMLH1蛋白结合形成异源二聚体hMutLα，hMutLα识别并结合错配修复的碱基，继而激活核酸内切酶，切除错配的碱基。hMSH6具有ATP酶活性，在错配修复过程中发挥调节作用，还可与hMSH2蛋白形成二聚体，接受ATP供能，与相应的错配碱基结合并将其游离。在DNA复制过程发生碱基错配后，MMR系统启动修复。修复过程包括错配碱基识别、MMR蛋白聚集、错配碱基修复。相应的MMR蛋白在形成异二聚体后，切除包含错配碱基的DNA片段，然后补充新合成的正确DNA片段，以确保基因信息准确。当MMR基因发生突变或修饰后，MMR蛋白表达缺失，继而MMR功能缺失，最终导致肿瘤发生[9]。MMR蛋白低表达可降低基因错配修复功能，增加肿瘤发生的易感性。其引起肿瘤发生的机制：①MMR功能缺失可引起基因组变化，造成简单重复序列的累积，发生微卫星不稳定，而微卫星不稳定可造成某些癌基因的激活，进一步诱发肿瘤[10]；②MMR系统缺陷会直接造成某些原癌基因和抑癌基因突变，如无法及时纠正，将导致癌基因异常表达、累积，最终导致肿瘤发生。

本研究结果显示，SCC组织MMR蛋白表达缺失率达16.1%，与Ghanipour等[11]研究结果基本一致。既往研究发现，MMR蛋白表达缺失与肿瘤某些临床病理特征有关[12，13]。本研究发现，MMR蛋白表达缺失与肿瘤直径、TNM分期、组织分化程度、淋巴结转移有关，与既往研究[14，15]结果基本一致。有研究发现，MMR蛋白表达变化与肿瘤患者预后密切相关[14，16]；以5-Fu为基础的化疗可延长结直肠癌患者生存时间，提高患者5年生存率[17]。但也有研究认为，dMMR者无法从以5-Fu为基础的化疗方案中获益，对TNM分期为Ⅱ期的dMMR者甚至有害[18]。本研究发现，dMMR者5年无病生存率及总生存率均高于pMMR者。提示dMMR者预后相对较好，可能与MMR可增强患者免疫监视功能有关[19]，也可能与肿瘤组织胸苷合成酶和二氢嘧啶脱氢酶过表达有关[13]。

综上所述，SCC组织可出现MMR蛋白表达缺失，其表达变化与肿瘤的发生、发展及患者预后有关。

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