生存素小分子干扰RNA对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生存素基因表达及生物学功能的影响

魏明 师广勇 刘佳 龚艳杰 陈河涛 梁颖红 涂玲

450052郑州大学第五附属医院检验科

生存素是凋亡抑制蛋白家族的成员之一，参与细胞周期调控，与肿瘤发生、发展和预后密切相关［1⁃2］。因此，针对生存素的靶向治疗有可能最大程度降低对正常组织的损伤，获得良好的抗肿瘤效果。RNA干扰是一项基因阻断技术，采用与靶基因同源的小分子干扰RNA（siRNA）转染靶细胞，诱导靶基因mRNA特异性降解，从而抑制目的基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的新方向。为此，我们将生存素基因序列特异性siRNA转染至皮肤鳞状细胞癌A431细胞，探讨体外转录siRNA能否有效介导肿瘤细胞出现RNA沉默，进而影响A431细胞增殖和凋亡，探索治疗皮肤鳞状细胞癌靶基因。

一、材料与方法

1.主要试剂及材料：A431细胞来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。RNA提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司），MTT、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司），改良Eagle培养基（DMEM）及胎牛血清（美国Gibco公司），细胞侵袭和迁移实验试剂（美国Corning公司），细胞凋亡试剂和细胞周期检测试剂（美国BD公司），兔抗人生存素多克隆抗体一抗及内参β肌动蛋白抗体、鼠抗兔二抗（北京科瑞生物科技有限公司）。

2.siRNA的设计与合成：通过siRNA分子库技术，设计并合成15种序列，从中筛选出1种高效生存素siRNA，其正义链序列：5′⁃GCAGATCTTGCTTCGCGATGTACGGGCC⁃3′，反义链序列：5′⁃CGTCGCGAGGGCTATGAACTAATGACCC⁃3′；无关序列siRNA的正义链：5′⁃AAGGCUAAGGGGCCGAU GACG⁃3′，反义链：5′⁃TUUCCGAUUCCCCGGCUACUGC⁃3′。生存素siRNA、无关序列siRNA均由北京汉博生物技术有限公司合成。本实验使用前期工作中研究的脂质体包裹siRNA，达到传输目的。包裹方法采用预制囊泡法，按阳离子脂质∶二硬脂酰磷脂酰胆碱∶胆固醇∶聚乙二醇（400）二甲基丙烯酸酯=40∶10∶40∶10（摩尔比）的比例制备成预制囊泡。将50.0 nmol/L生存素siRNA、无关序列siRNA和预制囊泡分别温浴于35～40℃5 ml乙醇溶液（300 ml/L）中10 min。将生存素siRNA和无关序列siRNA分别加入到预制囊泡中，形成包封生存素siRNA阳性脂质体和无关序列siRNA阴性脂质体。包封、浓缩，除菌后备用。

3.细胞培养与转染：用含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的DMEM高糖培养基于37℃、100%湿度、5%CO2孵箱中单层传代培养A431细胞。每隔24～48 h更换1次培养基。再将A431细胞铺于无抗生素的6孔培养板中，培养24 h，细胞密度为2×105个/孔。实验分为生存素siRNA组（用阳性脂质体转染）、阴性对照组（用阴性脂质体转染）及空白对照组（只加预制囊泡），37℃培养4～6 h后加入含血清的RPMI 1640培养液，37℃继续培养，根据需要收集转染后不同时间细胞进行检测。

4.实时定量反转录（RT）⁃PCR检测生存素mRNA表达水平：收集转染后48 h的A431细胞，提取、纯化总RNA，RT⁃PCR检测靶基因生存素mRNA表达水平，β肌动蛋白为内参。生存素基因：正向引物5′⁃ACGACCCCATAGAGGAACAT⁃3′，反向引物5′⁃TCCGCAGTTTCCTCAAATTC⁃3′，长度386 bp；β肌动蛋白基因：正向引物5′⁃GAAGTGAAGGGTCGGAGTC⁃3′，反向引物5′⁃GAAGATGGTGATGGGATTTC⁃3′，长度257 bp。按试剂盒说明书进行操作，采用实时定量RT⁃PCR检测，2－△△Ct法计算mRNA相对表达量。

5.Western印迹法检测A431细胞生存素蛋白表达水平：收集转染后48 h的A431细胞，按照说明书提取总蛋白。取40 μg蛋白质进行12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将产物转至二氟化树脂膜上，室温封闭2 h，加入兔抗人生存素，4℃过夜，TBST洗膜，加入鼠抗兔IgG标记辣根过氧化物酶，37℃孵育1 h。加入显色底物，显色2 min，曝光后X线片通过HPIAS⁃1000图像分析系统半定量分析。

6.MTT法检测A431细胞增殖：将细胞铺入96孔板，每孔100 μl，细胞密度为5 × 104个/ml，待细胞贴壁后，按上述分组方法处理，常规孵育24、48、72、96 h，每孔加入质量浓度5 g/L MTT溶液20 μl，培养4 h。终止培养，小心吸去孔内液体。每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡10 min。每组细胞设3个平行孔。酶标仪570 nm波长处测量各孔吸光度（A值），计算细胞增殖抑制率（%），即［1－（A生存素siRNA组－A空白对照组）/（A阴性对照组－A空白对照组）］×100%。

7.流式细胞仪检测A431细胞周期：将上述转染后48 h的各组细胞消化、离心，用预冷PBS混悬，冲洗2次，加入预冷75%乙醇3 ml，收集细胞，按照说明书用RNA酶处理细胞后，加入碘化丙啶（PI），4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测A431细胞周期变化。

8.生存素siRNA对A431细胞迁移的影响：按上述方法处理各组细胞，转染后24 h收集细胞，制备单细胞悬液，细胞密度为1×106个/ml。取细胞悬液100 μl放入3个细胞小室，细胞小室的下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养10 h后取出细胞小室，PBS浸泡洗涤，用预冷的80%乙醇固定，PBS浸泡洗涤，伊红染色，PBS快速洗涤。取出小室放入盛有3 ml PBS的6孔板中。倒置荧光显微镜下随机取6个视野计数（200倍），取平均值。

9.Transwell实验检测A431细胞侵袭力：取稀释的Matrigel胶（40 μl Matrigel+80 μl无血清培养基）30 μl加入细胞小室上室，覆盖整个聚碳酯膜，37℃30 min后取出培养板，将小室四周多余的稀释Matrigel胶吸掉，再放入37℃中使Matrigel胶聚合成胶备用。拿出已铺上Matrigel胶的细胞小室，加入对应分组稀释后的细胞悬液100 μl；细胞小室的下室加入500 μl 10%胎牛血清的DMEM培养基，置培养箱24 h后取出固定后并染色。倒置荧光显微镜下随机取6个视野（200倍）计数细胞。

10.流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法检测细胞凋亡：按上述方法处理各组细胞，每组设3个平行孔。转染后24 h，PBS洗涤，胰酶消化。冷培养基中止消化后移入EP管。1 000×g离心5 min，弃上清液。冷PBS清洗细胞，1 000×g离心5 min，弃上清液。每管加入1×结合缓冲液200 μl悬浮细胞（细胞密度为1×106个/ml）。避光下每管加入3 μl AnnexinⅤ结合物FITC，然后再加入2 μl PI，混匀，室温避光孵育15 min，置于冰上。流式细胞仪检测细胞凋亡。

11.统计学处理：采用SPSS13.0软件进行处理。计量资料以±s表示，实验数据经正态性检验，多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD⁃t检验，细胞增殖数据采用重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.生存素siRNA对A431细胞生存素mRNA及蛋白表达的影响：见表1。生存素siRNA转染后48 h，3组间生存素mRNA及蛋白相对表达量差异均有统计学意义（P＜0.001），而阴性对照组与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图1、2。生存素siRNA组生存素mRNA显著低于阴性对照组和空白对照组（LSD⁃t=12.34、15.36，P=0.002、0.002），见图1，而生存素蛋白表达亦显著低于阴性对照组和空白对照组（LSD⁃t=17.28、21.33，P=0.002、0.001）。

2.生存素siRNA对抑制A431细胞增殖的影响：见图3。重复测量方差分析显示，转染生存素siRNA能明显抑制A431细胞增殖（F=13.19，P=0.004）。组间两两比较显示，生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率明显高于阴性对照组和空白对照组（均P＜0.05），而阴性对照组与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组A431细胞增殖抑制率有随时间变化的趋势（F=23.43，P=0.003）。分组与培养时间因素之间不存在交互作用（F=1.29，P=0.260）。

3.生存素siRNA对A431细胞凋亡的影响：见表1。生存素siRNA组、阴性对照组、空白对照组A431细胞凋亡率差异有统计学意义（P=0.002）。生存素siRNA组显著高于阴性对照组和空白对照组（LSD⁃t=11.28、10.25，均P＜ 0.05），而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图4。

表1 生存素小分子干扰RNA（siRNA）对A431细胞生存素mRNA及蛋白表达和细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭力的影响（±s）

表1 生存素小分子干扰RNA（siRNA）对A431细胞生存素mRNA及蛋白表达和细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭力的影响（±s）

注：n=3

组别生存素siRNA组阴性对照组空白对照组F值P值生存素mRNA 0.56±0.15 0.88±0.37 0.90±0.43 276.67＜0.001生存素蛋白0.59±0.04 0.86±0.05 0.91±0.07 243.61＜0.001细胞凋亡率（%）21.45±2.39 8.91±1.34 9.22±1.48 83.97 0.002 G2/M期细胞比例（%）17.38±3.68 7.75±1.45 5.26±2.12 65.29 0.002细胞迁移数39.96±6.83 83.14±7.68 85.26±9.20 368.48＜0.01细胞侵袭数24.67±5.94 46.23±6.37 48.26±7.45 296.34＜0.01

4.生存素siRNA对A431细胞周期的影响：见表1。转染生存素siRNA后48 h，A431细胞周期发生明显变化，3组间G2/M期细胞比例差异有统计学意义（F=65.29，P=0.002）。生存素siRNA组G2/M期细胞比例高于阴性对照组和空白对照组（LSD⁃t=9.47、11.92，均P＜ 0.05），而阴性对照组与空白对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。

5.生存素siRNA对A431细胞迁移及侵袭能力的影响：见表1。3组间A431细胞迁移数及侵袭数差异均有统计学意义（均P＜0.01）。两两多重比较显示，转染生存素siRNA后，其A431细胞迁移数及侵袭数均明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。而阴性对照组细胞迁移数和侵袭数与空白对照组比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。

三、讨论

近来，基因疗法的应用逐渐成为皮肤鳞状细胞癌的研究热点，并取得一系列进展［3⁃5］。生存素具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。该基因几乎在所有种类的肿瘤组织中有表达，而正常组织几乎不表达［6⁃7］。生存素在肿瘤细胞中高表达后，不但抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞有丝分裂，还参与血管形成和放化疗耐受等多种功能。因此，针对生存素基因的肿瘤靶向治疗受到国内外学者的广泛关注［8⁃10］。

本研究通过转染生存素siRNA调控A431生存素蛋白和mRNA表达以及细胞增殖和凋亡，结果显示，在转染后48 h生存素mRNA和蛋白表达均下调，转染后24 h细胞凋亡率增加，且细胞增殖抑制率随培养时间延长而逐渐增加。提示RNA干扰在体外能成功沉默A431细胞的生存素基因，抑制A431细胞增殖，促进细胞凋亡。陈思远等［11］在黑素瘤细胞株A375中也观察到相似的变化，证实生存素具有抑制凋亡和调节细胞增殖的作用。此外，有研究表明［12⁃13］，生存素能特异性表达于细胞周期的G2/M期，它与有丝分裂纺锤体微管结合，使肿瘤细胞免遭凋亡并顺利通过G2/M期完成异常有丝分裂，而微管中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase⁃3）和Caspase⁃7处于抑制状态，这可能是生存素对G2/M期凋亡抑制的机制之一。

皮肤鳞状细胞癌的侵袭和转移是主要的致死因素。本研究显示，从基因水平抑制生存素的表达可以有效抑制A431细胞穿越基质胶处理过的Transwell小室的能力，提示抑制生存素的表达可以使A431细胞穿膜侵袭活力下降，表明生存素在肿瘤细胞的侵袭行为中可能起重要作用。

总之，体外小分子干扰生存素基因可以抑制A431细胞生存素的表达，从而影响细胞增殖和凋亡，但对生存素参与鳞状细胞癌形成的具体机制仍需进一步研究。

图1 生存素siRNA对A431细胞生存素mRNA表达的影响M：DNA标记物；1：空白对照组；2：阴性对照组；3：生存素siRNA组

图2 生存素siRNA对A431细胞生存素蛋白表达的影响 1：空白对照组；2：阴性对照组；3：生存素siRNA组

图3 生存素siRNA对A431细胞增殖的影响 空白对照组细胞增殖抑制率处于较低水平，且基本不随时间增加；阴性对照组细胞增殖抑制率略高于空白对照组，随时间缓慢增加；生存素siRNA组A431细胞增殖抑制率随时间逐渐升高，72 h后仍明显高于阴性对照组和空白对照组

图4 生存素siRNA对A431细胞凋亡的影响 4A：空白对照组；4B：阴性对照组；4C：生存素siRNA组。B2区为凋亡细胞，其凋亡细胞明显多于空白对照组和阴性对照组 图5生存素siRNA对A431细胞周期的影响 5A：空白对照组；5B：阴性对照组；5C：生存素siRNA组。生存素siRNA组G2/M期细胞比例明显高于阴性对照组和空白对照组

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