天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞及其产生特异性抗体的功能研究

元慧杰 周生儒 刘芝翠 朱海琴 许人超 郑捷 潘萌

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科

天疱疮是一种以皮肤、黏膜为靶器官的自身免疫性大疱性皮肤病，通常认为外周血循环中的特异性抗桥粒芯糖蛋白1（desmoglein1，Dsg1）和（或）Dsg3抗体通过破坏角质形成细胞间的桥粒结构，导致局部棘层松解，形成表皮内水疱［1］。目前多数学者认为［2⁃3］，天疱疮的致病性自身抗体来源于外周血循环中的B细胞，皮肤仅作为靶器官而发生疾病。因此，目前对于天疱疮免疫机制的研究多集中于外周血B淋巴细胞及其自身抗体的致病性［4⁃5］，而皮损局部的免疫应答反应则未曾有报道。为明确天疱疮患者皮损局部是否存在抗原特异性B淋巴细胞的浸润，是否可以在局部产生特异性抗体，我们对寻常型天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞的表型及其功能进行探讨。

一、对象与方法

（一）对象：2013年9月至2015年6月初诊、未经治疗并随访于上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科的35例寻常型天疱疮患者（皮肤黏膜型），均根据临床表现、组织病理、免疫荧光和自身抗体检测确诊。健康对照皮肤组织来自皮肤科门诊手术室接受色素痣切除术的22例患者。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

（二）主要试剂和仪器：别藻蓝蛋白（APC）-抗人CD19、异硫氰酸荧光素（FITC）-抗人IgG流式抗体产自美国BD公司，Alexa⁃Fluor®647-抗人DYKDDDDK标签抗体、藻红蛋白（PE）-抗人His标签抗体产自美国CST公司，RPMI 1640培养液、胎牛血清、透明质酸酶、DNA酶及Ⅴ型胶原酶产自美国Sigma⁃Aldrich公司，抗人Dsg1、Dsg3抗体ELISA试剂盒产自日本MBL公司，LymphoprepTM淋巴细胞分离液产自挪威Axis⁃shield公司。FACS CantoⅡ及LSR Fortessa型流式细胞仪为美国BD公司产品。重组人Dsg1、Dsg3由清泓生物技术（上海）有限公司合成。

（三）方法：

1.皮损局部单个核细胞分离：取12例健康对照正常皮肤和20例寻常型天疱疮患者初发水疱或糜烂皮损组织各1 cm×1 cm，在含Ⅴ型胶原酶、DNA酶及透明质酸酶的消化液中37℃消化2 h，用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法（800×g，15 min）分离获得单个核细胞。

2.流式细胞仪检测CD19+B细胞、CD19+IgG+B细胞、CD19+CD27+记忆B细胞及CD19+IgD+初始B细胞：每2×105个皮损单个核细胞重悬于100 μl RPMI 1640培养液（含5%胎牛血清）中，根据不同流式抗体组合，按照抗体与培养液的体积比例1∶100分别加入荧光抗体，用FACS CantoⅡ流式细胞仪和FlowJo软件检测和分析。

3.流式细胞仪检测表面识别Dsg1、Dsg3的CD19+B细胞：每2×105个皮损单个核细胞重悬于100 μl RPMI 1640培养液（含5%胎牛血清）中，分别加入0.5 μg重组人Dsg1和Dsg3，室温孵育1 h，培养液洗涤1次，根据不同流式抗体组合，按照抗体与培养液的体积比例1∶100分别加入荧光抗体，用FACS CantoⅡ流式细胞仪和FlowJo软件检测和分析。

4.皮损局部单个核细胞的体外培养及上清液中抗Dsg1、抗Dsg3抗体检测：每2 × 105个细胞重悬于200 μl含10%胎牛血清、200 mg/L青霉素和200 U/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃培养6 d后收集上清液。

按照ELISA试剂盒的抗体检测说明，将上清液按1∶101稀释后加入微孔中，于室温孵育1 h后洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IgG抗体，于室温孵育1 h，洗涤孔板后再加入底物四甲基联苯胺（TMB）于室温孵育0.5 h，加入终止液终止反应，采用全自动定量酶标仪在450 nm波长下读取吸光度（A值），并通过试剂盒说明中的公式（A样本-A阴参）×100%/（A阳参-A阴参）计算培养上清液中抗体的滴度值。

采用受试者工作特征曲线（ROC）判断皮损处单个核细胞产生特异性抗体的有效性［6］，根据ROC统计分析输出的灵敏度与特异度，计算约登指数（灵敏度+特异度-1），约登指数最大值所对应的滴度值为临界值，抗体滴度大于临界值即为阳性。

5.统计学方法：用Graphpad 5.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示；用非参数Mann⁃WhitneyU检验及Welch′sT检验比较两组间差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

（一）寻常型天疱疮患者皮损局部B淋巴细胞比例：流式细胞仪检测15例（分离的单个核细胞数≥2×105）寻常型天疱疮患者皮损及12例健康对照皮肤分离后的单个核细胞，患者组淋巴细胞比例为（17.95±3.85）%，健康对照组为（7.83±1.29）%（图1A），两组差异有统计学意义（t=2.49，P=0.023 4）。患者组CD19+B细胞比例为（4.27±1.13）%，健康对照组为（0.61± 0.31）%（图1B），差异亦有统计学意义（U=13.00，P=0.000 2）。

（二）患者皮损局部CD19+B细胞为Dsg特异性B细胞：15例天疱疮患者皮损局部CD19+B淋巴细胞中，表达IgG的细胞比例为（38.33±5.56）%，3例天疱疮患者皮损局部CD19+B淋巴细胞中表面特异性识别Dsg1与Dsg3的细胞比例分别为（12.87 ± 1.267）%、（10.42 ± 1.243）%。

（三）寻常型天疱疮患者皮损局部单个核细胞体外培养后产生抗Dsg1及抗Dsg3特异性抗体：将20例寻常型天疱疮患者皮损与10例健康对照皮肤局部单个核细胞分别体外培养6 d后，患者组培养上清液中抗Dsg1与Dsg3抗体滴度分别为（4.89 ± 1.56）、（35.45 ± 13.03）U/ml，健康对照组分别为（-0.36 ± 0.25）U/ml、（-0.29 ± 0.29）U/ml，两组间差异有统计学意义（U值为13.0、5.0，P＜0.05）。培养上清液中抗Dsg1和Dsg3抗体的曲线下面积分别为0.938与0.975（图2），滴度临界值分别为0.64和0.92。患者皮损单个核细胞培养上清液抗Dsg1和Dsg3抗体分别有17例（85%）、19例（95%）为阳性。

三、讨论

我们在临床上观察到，一些复发天疱疮患者的皮损通常发生在与初发皮疹完全相同的部位，对复发患者不增加系统糖皮质激素用量，仅加强外用治疗，皮疹就能得到控制；而部分落叶型或红斑型天疱疮患者，仅外用糖皮质激素治疗，皮疹也可好转。这引起了我们对天疱疮患者皮损局部免疫环境研究的兴趣。

过去的研究认为，B淋巴细胞通常不在皮肤聚集［7］。但在炎症性皮肤病的动物模型及人类临床研究中发现，B细胞可发挥促炎及抗炎作用［8］。目前已在皮肤利什曼病［9］、弥漫性皮肤硬化［10］和特应性皮炎［11］等皮损真皮部位发现有B细胞浸润，B细胞与皮肤固有免疫细胞及T细胞相互作用共同参与皮肤炎症发生。本研究发现，B细胞浸润于天疱疮患者皮损局部，这可能是因为皮损部位基质细胞或T淋巴细胞表达趋化因子（CXCL13、CCL19等）与B细胞表面的趋化因子受体（CXCR5或CCR7）结合，趋化B细胞至患者皮损部位［12⁃14］。

图1 寻常型天疱疮患者皮损处与健康对照皮肤单个核细胞中淋巴细胞与CD19+B细胞的比例 1A：淋巴细胞比例；1B：CD19+B细胞比例

图2 体外培养局部单个核细胞产生抗桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）、Dsg3抗体的受试者工作特征曲线 曲线下面积分别为0.938、0.975

皮肤局部的免疫过程可能受到机体整体免疫的影响，而Geherin等［15］在绵羊肉芽肿模型中发现，皮肤中聚集的B细胞表型不同于淋巴结中的B细胞，其表面MHCⅡ、CD1和CD80/86表达增加，有利于T细胞活化，同时皮损局部B细胞和抗体产生细胞的聚集增加了局部抗体的浓度，进而加重了自身免疫的发生。我们的研究也发现，寻常型天疱疮患者皮损局部浸润的B细胞表面高表达IgG，可与Dsg1与Dsg3特异性结合，可能是由于局部的T、B细胞容易被活化。Mahanonda等［16］发现，正常齿龈及齿龈炎组织有CD20+/27+记忆性B细胞浸润，表面表达IgG和IgA，在体外用Toll样受体7/8（R848）及白细胞介素2刺激后可分化为分泌IgG和IgA的抗体分泌细胞。本研究中，天疱疮患者皮损局部浸润的B细胞，体外培养6 d后产生抗Dsg1和Dsg3抗体，提示浸润的B细胞可分化成为抗体分泌细胞，可能参与天疱疮的发生。

综上，本研究发现，寻常型天疱疮患者皮损局部有大量淋巴细胞浸润，其中包括B淋巴细胞，这些B细胞表面表达IgG，并以记忆性B细胞为主，可与Dsg1、Dsg3特异性结合，在体外培养后，可产生抗Dsg1与Dsg3特异性抗体，在皮损形成过程中发挥重要作用。

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