光老化对皮肤成纤维细胞降解晚期糖基化终末产物的影响

许新雅 郑跃 许庆芳 黎钰莹 黄云芬 龚子鉴 陆春 赖维

510630广州，中山大学附属第三医院皮肤科

晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGE）是蛋白质、脂类、核酸等大分子物质的游离氨基与还原糖通过非酶糖化反应生成不易降解的大分子棕色产物［1］。研究发现，AGE在光老化皮肤中大量堆积，并在光老化多个环节中起重要作用［2］，但其堆积机制不明。研究发现，通过胞外途径不能降解光老化皮肤组织中AGE，基质金属蛋白酶在光老化皮肤和皮肤成纤维细胞中表达和活性升高，但依然不能降解AGE［3］；胃蛋白酶和蛋白酶K能降解AGE，但它们只存在于胃肠消化系统中［4］。然而，AGE可被巨噬细胞、成纤维细胞等胞吞后被溶酶体或泛素蛋白酶体降解清除［5］。光老化皮肤成纤维细胞是否对吞入胞内AGE的降解变缓，进而在皮肤AGE堆积中起作用，目前还不清楚。我们检测AGE-牛血清白蛋白（BSA）在光老化/非光老化成纤维细胞内堆积和降解情况，探讨光老化皮肤AGE堆积机制。

材料与方法

一、材料

1.皮肤成纤维细胞：正常皮肤组织来自中山大学附属第三医院泌尿外科3名儿童包皮环切术后包皮组织，年龄5～9岁。本研究通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。

2.试剂和仪器：DMEM高糖培养基、胰酶、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）及青、链霉素均为美国Gibco公司产品；AGE⁃BSA为美国Biovision公司产品；细胞衰老β半乳糖苷酶（SA⁃β⁃Gal）试剂盒为美国Cell signaling technology公司产品；LysoTracker RedDND⁃99为美国ThermoFisher公司产品；SYTO®13为美国Life Technologies公司产品；细胞凋亡试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。UVA紫外线照射仪（Sigma SS⁃03A，灯管为 Philips UVA TL10RS，波长320～400 nm）与UVA照射计均产自上海希格玛高科技有限公司。流式细胞仪（美国BD Biosciences公司），激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司）。

二、方法

1.原代皮肤成纤维细胞培养：取儿童包皮参照文献［6］分离培养皮肤成纤维细胞，第3代细胞冻存。细胞复苏后10代以内的细胞行后续实验。在AGE⁃BSA处理细胞3 d前及AGE⁃BSA孵育细胞过程中，均以含2%胎牛血清的细胞培养液培养各组细胞。

2.连续UVA照射诱导成纤维细胞光老化：实验分为连续UVA照射组和空白对照组。将3～10代成纤维细胞按1×106/皿接种于直径6 cm的细胞培养皿，待细胞长到70%融合时，吸弃培养液，PBS洗涤2次后每皿加2 ml PBS。将UVA照射组细胞置于UVA辐照仪下，细胞距离光源15 cm，平均照射功率为12.7 mW/cm2，设置单次照射时间为780 s，照射剂量为9.9 J/cm2［7⁃9］，每日同一时间照射1次，连续照射14 d。空白对照组细胞加入PBS后置于超净台避光。

3.CCK8法检测皮肤成纤维细胞增殖活性：将末次UVA照射后成纤维细胞按5×103个/孔接种于96孔培养板中，每孔含100 μl细胞培养液，每组各设3个复孔。细胞培养24 h后，每孔加10 μl CCK8试剂，37℃孵育4 h，在酶联免疫检测仪上测定450 nm处吸光度（A值）。细胞活性（%）=（AUVA照射组-A空白孔）/（A对照组-A空白孔）×100%，实验重复3次，取均值。

4.β半乳糖苷酶染色检测老化比率：末次UVA照射后48 h去除细胞培养基，PBS洗涤1次，按照试剂盒说明书检测细胞老化。光镜下观察结果，老化细胞胞质被染成蓝色，每皿至少计数500个细胞，计算阳性细胞所占百分比。实验重复3次，取均值。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡率：末次UVA照射后，用胰酶消化细胞，调整细胞为1×106/ml。每组取1 ml细胞，预冷PBS洗涤3次后细胞重悬于200 μl结合缓冲液。加入10 μl膜联蛋白V异硫氰酸荧光素及10 μl碘化丙锭，轻轻混匀，4℃反应30 min。加入300 μl结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取均值。

6.流式细胞仪检测吞入胞内的AGE⁃BSA在光老化/非光老化成纤维细胞内的堆积：因AGE⁃BSA具有自发性荧光，激发光波长（λex）为370 nm、发射光波长（λem）为440 nm，可用流式细胞仪检测细胞在该波长下的荧光强度以定量胞内AGE⁃BSA。取原代成纤维细胞分为4组：光老化组（以UVA照射诱导光老化），非光老化组（不做处理），光老化+AGE组（以UVA照射诱导光老化后加入AGE⁃BSA孵育），非光老化+AGE组（未诱导光老化细胞中加入AGE⁃BSA孵育）。参照前期研究［10］，200 mg/L AGE⁃BSA是最大无细胞毒性浓度。在各组细胞中加或不加入200 mg/L AGE⁃BSA，孵育4、8、16、24、48、72 h收集细胞，预冷PBS洗涤3次，200 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测并记录激发波长370 nm处荧光。实验重复3次，取均值。

7.激光共聚焦定位、半定量细胞内AGE⁃BSA：分组同上。流式细胞仪检测发现，在AGE⁃BSA孵育8 h时，光老化和未老化细胞内AGE⁃BSA含量最高，因此在孵育8 h时检测各组细胞内AGE⁃BSA。PBS洗涤细胞2次后，加入含有70 nmol/L LysoTracker Red DND⁃99（标记溶酶体膜）的细胞培养基避光孵育1 h，PBS洗涤3次，再加入含有125 nmol/L SYTO 13（标记细胞核）的培养基避光孵育30 min，PBS洗涤3次，在激光共聚焦显微镜下观察，每皿随机取3个无重叠视野拍摄并计算AGE⁃BSA平均荧光强度（油镜，×63）。在激光共聚焦显微镜下可观察到3种荧光：AGE⁃BSA呈蓝色，LysoTracker Red DND⁃99标记的溶酶体呈红色，SYTO13标记的细胞核呈绿色。实验重复3次，取均值。

8.ELISA检测吞入胞内的AGE⁃BSA在光老化/非光老化细胞内降解差异：分组同上。在各组细胞中加入或不加入200 mg/L AGE⁃BSA，孵育8 h后去除AGE⁃BSA，继续培养细胞24 h，收集8 h和32 h点各组细胞总蛋白并定量。按照AGE ELISA检测试剂盒说明操作，最后根据各样品的A405值计算AGE浓度。根据（T8h-T32h）/T8h计算AGE⁃BSA在各组细胞中的降解率。实验重复3次取均值。

9.统计学处理：采用SPSS 20.0统计软件，各组数据均以±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），各组间两两比较采用LSD⁃t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、连续UVA照射对成纤维细胞老化及凋亡的影响

UVA照射组细胞活性为（78±6.1）%，较对照组（100%）明显下降（t=7.559，P＜0.05）。UVA照射组和对照组β半乳糖苷酶染色阳性率分别为（81.37±2.90）%和（8.03±0.31）%，前者显著高于后者（t=43.524，P＜0.05）。UVA照射组细胞凋亡率为（20±2.5）%，显著高于对照组细胞［（10± 1.1）%，t=14.075，P＜ 0.05］。

二、吞入胞内AGE⁃BSA在光老化/非光老化成纤维细胞内堆积差异

图1 流式细胞仪检测晚期糖基化终末产物-牛血清白蛋白在光老化/非光老化成纤维细胞内的堆积差异

见图1。200 mg/L AGE⁃BSA孵育成纤维细胞后，光老化和非光老化成纤维细胞内AGE⁃BSA荧光强度均逐渐升高，在8 h点达到最高，此后逐渐下降，24 ～ 72 h间变化差异无统计学意义。4、8、16、24、48、72 h时光老化+AGE组、非光老化+AGE组AGE⁃BSA荧光强度均显著高于相应时间点无AGE⁃BSA孵育的光老化组及非光老化组（均P＜0.05）；光老化细胞内AGE⁃BSA荧光强度显著高于非光老化细胞（P＜0.05）。

三、激光扫描共聚焦显微镜定位、半定量细胞内AGE⁃BSA

见图2。激光扫描共聚焦显微镜镜下发现，细胞内发蓝色荧光的AGE⁃BSA与发红色荧光的溶酶体位置一致，表明吞入胞内AGE⁃BSA主要位于溶酶体内。用ImageJ图像分析软件行灰度扫描半定量蓝色荧光，光老化+AGE组、光老化组、非光老化+AGE组、非光老化组AGE⁃BSA荧光强度分别为292.63 ± 2.58、227.33 ± 1.11、249.33 ± 0.71、182.73 ±2.22，各组间差异有统计学意义（F=1887.25，P＜0.05）。LSD⁃t检验发现，光老化+AGE组显著高于其他3组（均P＜0.05），非光老化+AGE组显著高于非光老化组（P＜0.05）。

四、AGE⁃BSA在光老化/非光老化细胞内降解差异

见表1。孵育32 h时光老化细胞AGE浓度较8 h下降（7.6±1.4）%，而非光老化细胞AGE浓度下降（14.6±1.2）%，前者显著低于后者（t=6.604，P＜0.05）。

图2 激光扫描共聚焦显微镜观察晚期糖基化终末产物-牛血清白蛋白（AGE⁃BSA）在光老化/非光老化成纤维细胞内的堆积（油镜，× 63） 蓝色：AGE⁃BSA，红色：溶酶体

表1 AGE⁃BSA在光老化/非光老化成纤维细胞内的降解差异（±s）

表1 AGE⁃BSA在光老化/非光老化成纤维细胞内的降解差异（±s）

注：n=3。AGE⁃BSA，晚期糖基化终末产物-牛血清白蛋白

组别非光老化组非光老化+AGE组光老化组光老化+AGE组AGE（ng/mg）8 h 275.80±5.53 421.24±8.04 321.67±3.90 495.27±8.60降解率（%）32 h 274.23±5.58 359.83±8.83 320.60±3.83 457.43±14.39 0.57±0.14 14.60±1.20 0.33±0.90 7.60±1.40

讨 论

研究显示，AGE在光老化皮肤大量堆积［2］，可促进活性氧簇生成和抑制超氧化物歧化酶活性［1］，促进角质形成细胞和成纤维细胞凋亡，上调基质金属蛋白酶表达，使胶原纤维和弹性纤维变性，与细胞表面受体结合后引发生物学效应等，进而在光老化中起重要作用。因此，越来越多的学者认为干预AGE堆积可以改善光老化［11⁃12］。然而，光老化皮肤AGE堆积机制目前还不明确。

本研究显示，以无细胞毒性剂量UVA连续照射成纤维细胞，细胞活性显著下降，而β半乳糖苷酶染色阳性率和细胞凋亡率均显著升高，表明连续UVA照射可成功诱导成纤维细胞光老化。接着，我们验证光老化/非光老化皮肤成纤维细胞是否可胞吞胞外AGE，发现AGE⁃BSA孵育的光老化和非光老化细胞内AGE⁃BSA荧光强度均分别显著高于无AGE⁃BSA孵育的光老化及非光老化细胞，且光老化细胞内AGE⁃BSA荧光强度显著高于非光老化细胞；共聚焦显微镜定位发现，吞入胞内的AGE⁃BSA主要位于溶酶体内。以上结果表明，光老化和非光老化成纤维细胞均可胞吞胞外AGE⁃BSA，并将吞入胞内的AGE⁃BSA输送至溶酶体内降解，提示成纤维细胞很可能在皮肤AGE降解及光老化皮肤AGE堆积中起重要作用。我们的结果还提示，AGE⁃BSA在光老化细胞内堆积明显高于正常成纤维细胞，由于一种物质在溶酶体内堆积常提示该物质降解减少［13］，故推测AGE⁃BSA在光老化成纤维细胞溶酶体内的降解很可能低于非光老化成纤维细胞。

为验证推测，我们以AGE⁃BSA孵育细胞8 h后去除，细胞继续培养24 h，采用ELISA检测各组AGE浓度在这两时点间的变化，发现光老化细胞AGE浓度下降程度显著低于非光老化细胞AGE，表明AGE⁃BSA在光老化细胞内降解明显低于非光老化细胞，揭示光老化抑制成纤维细胞对吞入胞内AGE的降解，进而促进AGE在光老化皮肤中的堆积。光老化通过什么机制抑制AGE在成纤维细胞内降解目前还不清楚。Grimm等［5］以纯化组织蛋白酶D、B以及20S蛋白酶体等分别孵育AGE，发现20S蛋白酶体完全不能降解AGE，组织蛋白酶D、B能降解AGE，其中组织蛋白酶D降解活性显著高于B。本研究发现，吞入成纤维细胞内的AGE⁃BSA主要位于溶酶体内，提示溶酶体蛋白酶很可能在胞内AGE降解中起主导作用。我们的前期研究还发现，溶酶体组织蛋白酶B、D及K在光老化皮肤及成纤维细胞中表达均降低［14］，提示光老化很可能通过降低组织蛋白酶B、D及K表达抑制吞入成纤维细胞内的AGE降解。何种蛋白酶在皮肤成纤维细胞降解胞内AGE中起关键作用，光老化是否通过抑制该酶表达和活性进而影响AGE胞内降解有待进一步研究。

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