MicroRNA⁃143对白介素13诱导的人角质形成细胞组织激肽释放酶7表达的影响

曾跃平 朱晨雨 陈程 贾倩楠 晋红中

100730北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院皮肤科 协和转化医学中心

特应性皮炎（AD）是一种慢性炎症性皮肤病，临床特征为严重瘙痒和复发性湿疹样皮损［1］。AD发病机制主要包括表皮屏障结构和功能异常以及免疫功能紊乱，在AD的发病过程中，二者存在相互作用、互为因果的联系［2］。本课题组的前期研究证实，白介素13（IL⁃13）可以下调角质形成细胞中表皮屏障相关蛋白如丝聚合蛋白、兜甲蛋白和内披蛋白的表达，而上调角质形成细胞中microRNA⁃143（miR⁃143）的表达则可逆转IL⁃13对以上3种蛋白表达的影响［3］。我们拟在前期工作基础上，探讨miR⁃143是否可以影响IL⁃13诱导的组织激肽释放酶7（kallikrein 7，KLK7）的表达，为miR⁃143在AD发病中的作用提供更多的理论依据。

材料与方法

一、细胞系、试剂和仪器

正常人皮肤原代角质形成细胞（primary normal human epidermal keratinocytes，NHEK）、无血清角质形成细胞培养基（德国Promo Cell公司），重组人IL⁃13蛋白（美国RD公司），反转录试剂盒、超级ECL发光试剂盒（美国Thermo Fisher公司），Trizol RNA提取液、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），SYBR Green qPCR Mix（广州东盛生物科技有限公司），miR⁃143 mimics、miR⁃NC（microRNA mimics阴性对照）（广州锐博生物科技有限公司），Bradford蛋白浓度测定试剂盒、iQ5实时荧光定量PCR仪（美国Bio⁃Rad公司），抗KLK7抗体（美国Santa Cruz公司）、3磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（天津三箭生物技术有限公司），天能Tanon 4200全自动化学发光成像分析系统（上海天能科技有限公司）。

二、方法

1.细胞培养和分组：NHEK常规复苏成功后，用无血清角质形成细胞培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞传至3至5代时，取对数生长期细胞接种于12孔培养板中（1×105/孔）,接受以下分组处理。①加入终浓度分别为0、2、10、50 μg/L的IL⁃13，继续孵育24 h后终止培养；②加入50 μg/L IL⁃13，分别孵育0、6、12、24、48 h后终止培养。以上两部分实验每组设3个复孔，终止培养后收集细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA用于后续实验。

2.细胞转染：在转染前1 d，用胰蛋白酶消化细胞后，以3 × 105个/孔接种于6孔板，37 ℃、5%CO2培养，使转染前细胞融合度为70%～80%。转染当天，换新鲜无抗生素完全培养基，37℃孵育，转染前拍照记录。采用Lipofectamine 2000将miR⁃143 mimics和miR⁃NC分别转染入NHEK，24 h后用荧光显微镜观察细胞转染效率（荧光细胞比例超过80%认为达到转染要求），拍照记录。NHEK分为4组，①NHEK组：不接受转染或 IL⁃13刺激；②IL⁃13组：仅用50 μg/L IL⁃13处理；③miR⁃NC组：转染microRNA mimics阴性对照 24 h 后用 50 μg/L IL⁃13 处理；④miR⁃143组：转染miR⁃143 mimics 24 h后用50 μg/L IL⁃13处理，孵育24 h，每组设3个复孔。收集细胞，分别提取细胞总RNA和总蛋白，用于后续实验。

3.实时荧光定量PCR检测KLK7基因mRNA水平：采用反转录试剂盒，按照标准实验流程将上述实验中提取的总RNA反转录为cDNA，按SYBR Green qPCR Mix试剂盒按说明书扩增目的基因。反应体系如下：cDNA模板5 μl，正反向引物各0.5 μl，2 × SYBR Green qPCR Mix 10 μl，去离子水4 μl，最终反应体积20 μl。引物序列：KLK7正向引物5′⁃GTGACTCAGGGGGACCGTT ⁃3′，反 向 引 物 5′⁃TCAGTGTGGCGTTAGCGAT⁃3′；β肌动蛋白正向引物5′⁃GCACCCAGCACAATGAAGA⁃3′，反向引物5′⁃AATAAAGCCATGCCAATCTCA⁃3′。PCR反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40个循环。以β肌动蛋白为内参照，记录各实验孔 Ct值，以 2⁃ΔΔCt表示目的基因的相对表达水平。

4.免疫印迹实验检测KLK7蛋白水平：采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定上述实验中提取蛋白样本浓度。制备聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜。采用封闭液室温封闭PVDF膜1 h，用新鲜配制的封闭液稀释一抗（抗体稀释比例KLK7 1∶200，GAPDH 1∶3 000），4℃过夜孵育。洗膜后加入二抗（稀释比均为1∶3 000），室温孵育PVDF膜1 h。以GAPDH为内参蛋白。洗膜后采用超级ECL发光试剂盒化学发光，在化学发光成像分析系统中显影。实验重复3次。使用ImageJ 1.51k软件测量目的蛋白条带的灰度值，并与GAPDH蛋白条带的灰度值对比，计算目的蛋白相对表达水平。

5.统计学方法：采用SAS 9.4统计软件分析。计量资料服从正态分布者采用±s进行统计学描述。KLK7 mRNA的相对表达水平与IL⁃13处理浓度和处理时间的趋势性采用线性趋势检验。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较首先采用单因素方差分析，再采用LSD⁃t检验进行两两间多重比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度IL⁃13对NHEK中KLK7基因mRNA水平的影响

0、2、10、50 μg/L IL⁃13组KLK7 mRNA的相对表达水平分别为1.00±0.12、0.89±0.04、1.15±0.09、1.70 ± 0.10，线性趋势检验发现，IL⁃13浓度与KLK7 mRNA相对表达水平之间有线性关系（F=92.48，P＜0.05），随着IL⁃13浓度升高，KLK7 mRNA相对表达水平有上升趋势。

二、IL⁃13处理NHEK不同时间对KLK7基因mRNA水平的影响

50 μg/L IL⁃13处理0、6、12、24和48 h后KLK7 mRNA相对表达水平分别为1.00±0.05、1.05±0.12、1.71±0.20、1.97±0.19、2.48±0.13。线性趋势检验发现，IL⁃13处理时间与KLK7 mRNA的相对表达水平之间有线性关系（F=206.44，P＜0.05），随着50 μg/L IL⁃13处理时间延长，KLK7 mRNA的相对表达水平有上升趋势。

三、miR⁃143对NHEK中IL⁃13诱导的KLK7 mRNA和蛋白表达水平的影响

1.转染效率：转染NHEK 24 h后，与明视场显微镜下对比，荧光显微镜观察同一视野下荧光细胞比例大于90%，故认为转染成功。

2.KLK7 mRNA表达水平比较：见表1。与NHEK组相比，IL⁃13组KLK7 mRNA相对表达水平升高（t=7.12，P＜0.05）。单因素方差分析显示，IL⁃13组、miR⁃NC组和miR⁃143组间KLK7 mRNA相对表达水平差异有统计学意义（F=26.89，P＜0.05），而IL⁃13组和miR⁃NC组间差异无统计学意义（t=0.91，P＞0.05），miR⁃143组低于IL⁃13组和miR⁃NC组，差异均有统计学意义（t=5.85、6.76，均P＜0.05）。

3.KLK7蛋白表达水平比较：见表1、图1。与NHEK组相比，IL⁃13组KLK7蛋白相对表达水平升高（t=4.85，P＜0.05）。单因素方差分析显示，IL⁃13组、miR⁃NC组和miR⁃143组间KLK7蛋白相对表达水平差异有统计学意义（F=13.26，P＜0.05），而IL⁃13组和miR⁃NC组间差异无统计学意义（t=0.42，P＞0.05），miR⁃143组低于IL⁃13组和miR⁃NC组，差异均有统计学意义（t=4.65、4.23，均P＜0.05）。

讨 论

目前认为，Th2型免疫反应在AD免疫功能紊乱中发挥主导作用，其中Th2型细胞因子如IL⁃4和IL⁃13起关键作用［2］。针对IL⁃4和IL⁃13共同受体IL⁃4Rα的生物制剂Dupilumab，目前已在美国上市，成为首个获批治疗AD的生物制剂［4］，这也显示IL⁃4和IL⁃13在AD发病中的核心作用。

表1 不同组别正常人皮肤角质形成细胞（NHEK）组织激肽释放酶7（KLK7）基因mRNA和蛋白的相对表达水平（±s）

表1 不同组别正常人皮肤角质形成细胞（NHEK）组织激肽释放酶7（KLK7）基因mRNA和蛋白的相对表达水平（±s）

注：n=3。a与NHEK组比较，P＜0.05；b与白介素13组比较，P＜0.05；c与miR⁃NC组比较，P＜0.05

组别NHEK组白介素13组miR⁃NC组miR⁃143组KLK7 mRNA 1.00±0.05 1.97±0.19a 2.08±0.15 1.26±0.10b c KLK7蛋白0.36±0.11 1.10±0.24a 1.05±0.06 0.56±0.03b c

图1 miR⁃143对白介素（IL）13诱导正常人皮肤角质形成细胞（NHEK）组织激肽释放酶7（KLK7）蛋白水平的影响 1：NHEK组；2：IL⁃13组；3：miR⁃NC组；4：miR⁃143组

KLK在皮肤中最主要的生理功能为促进皮肤脱屑，通过降解桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯胶蛋白1和角质层锁链蛋白来促进浅层角质形成细胞脱落，从而维持皮肤稳态［5］。KLK7是第一个从角质层中以活化形式鉴定出来的KLK，也是表皮中唯一的糜蛋白酶［5］。既往研究表明，KLK7转基因小鼠模型可呈现AD的临床特征［6］。与健康对照组比较，AD患者表皮KLK7蛋白表达水平升高，蛋白酶活性增强［7⁃10］。最新研究发现，若婴儿出生时表皮KLK7酶活性升高，可能与其日后发生皮肤屏障功能损伤和AD相关［11］。以上研究提示，降低KLK7的表达或阻断其过度活化的酶活性可作为AD的治疗策略之一。

体外实验表明，IL⁃4和IL⁃13可以诱导NHEK或HaCaT细胞中KLK7 mRNA和蛋白水平升高，酶活性增强［8，12⁃13］。提示在AD中，KLK7的表达和活性除了受蛋白酶抑制剂和各种理化因素影响外，还可能与机体的免疫功能紊乱，特别是Th2型免疫反应相关。但是，Th2型细胞因子调控KLK7表达的具体机制目前尚无报道。本研究结果显示，随着IL⁃13处理时间的延长和浓度升高，KLK7 mRNA表达均呈上升趋势，提示在体外实验中，KLK7表达与IL⁃13浓度和作用时间密切相关。

本研究结果显示，在NHEK中过表达miR⁃143可逆转IL⁃13对KLK7上调表达的效应。由于IL⁃13Rα 1是IL⁃13的重要受体之一，结合本课题组前期工作可以推测，miR⁃143针对KLK7表达的上述效应，也可能是通过直接负向调控IL⁃13Rα1来实现的。

参考文献

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