黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心律失常与内质网应激因子的影响*

刘 灏，呼日乐巴特+，熊 英，魏成喜，宣丽颖，王 羽△，赵 明△

（1.内蒙古民族大学附属医院，通辽028000；2.内蒙古医科大学第一临床学院，呼和浩特100059；3.内蒙古民族大学医学院，通辽028000）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由病毒感染心肌所致的疾病，其中以柯萨奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）最为常见。心律失常是VMC常见临床表现之一，严重者出现晕厥甚至阿-斯综合征，是造成 VMC病人猝死的主要原因［1］。内质网（endoplasmic reticulum，ER）是一种亚细胞器，主要功能是合成蛋白质并使合成的蛋白质由一级结构变成具有生理功能的空间结构。当各种原因导致内质网稳态失衡时，出现误折叠蛋白在内质网内异常聚集并引起内质网应激性蛋白分泌增加，识别错误折叠蛋白，通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即内质网应激反应（endoplasmic reticulum stress，ERS）［2］。黄芪总黄酮（total flavonoids of Astragalus，TFA）是从蒙古黄芪中分离的主要活性成分，本团队在前期研究中发现TFA可显著降低VMC小鼠心律失常发生率［3］，并能增加 CVB3病毒感染心肌细胞内向整流钾电流 （IK1）的幅值［4］，抑制 CVB3病毒感染心肌细胞葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）、GRP94表达，提高 Calumenin及缝隙连接蛋白 43（connexin 43，Cx43）表达［5］，提高 VMC小鼠急性期心肌组织Cx43 mRNA表达［6］，TFA通过抑制VMC小鼠心室肌细胞LCCsα1亚单位的mRNA表达，降低心室肌细胞钙通道开放时间、增加关闭时间、降低开放概率抑制心室肌细胞钙电流，缓解心肌细胞钙超载［7］。本研究通过观察TFA对病毒性心肌炎小鼠心律失常及心肌细胞GRP78，激活转录因子 4（activating transcription factor 4，ATF4）及 Cx43表达作用，部分揭示TFA抗病毒性心肌炎并发心律失常机制。

1 材料与方法

1.1 动物药品与仪器

GRP78抗体，Cx43抗体和ATF4抗体购自Boster公司，内参β-actin购自 wanleibio公司；BL-420生物机能实验系统购自成都泰盟软件有限公司。黄芪总黄酮系内蒙古民族大学蒙药心脑血管药理学重点实验室从内蒙通辽科尔沁区兆瑞种植社出产蒙古黄芪中提取，对提取的黄芪总黄酮采用高效液相色谱（HPLC）法进行含量测定，其6种成分的加样回收率均＞94%。TFA干粉制备成浓度为20 mg／L水溶液。36只雄性 Balb／c小鼠，4周龄，体质量13～15 g；CVB3（Nancy株）购自吉林大学农牧学院实验动物中心病毒室，病毒原液效价为10-3 TCID 50／L。

1.2 病毒性心肌炎BALB／c小鼠模型的制备

选清洁级雄性小鼠36只，随机分为正常对照组、病毒性心肌炎组和TFA组（n＝12）。病毒感染组与TFA组腹腔内无菌注射含0.1 ml 10-950TCID CVB3，正常对照小鼠组不注射CVB3病毒，注射0.1 ml生理盐水，每日注射1次，共3 d。TFA组小鼠每日尾静脉注射 0.1 ml TFA 20 mg／L，共 7 d。从注射病毒起每日观察小鼠的一般状态，主要观察小鼠的反应，详细记录小鼠饮食，毛色，活动和排泄情况。

1.3 心电图检测

实验结束后，各组小鼠腹腔注射2%戊巴比妥进行麻醉，BL420生理仪下行标II导联心电图检查。

1.4 病理取材及切片制作

心电图检查后，立即处死小鼠，在无菌状态下剪开小鼠左肋，去除心包后暴露心脏，取出心脏，将左心室肌组织放入4%多聚甲醛溶液固定、经乙醇脱水、石蜡包埋、将心肌切片脱蜡、二甲苯透明，行HE染色，于光镜下观察病理变化。

1.5 Western blot检测各组小鼠心肌细胞GRP78、ATF4及Cx43表达

各组小鼠心肌细胞提取蛋白质，采用SDS-PAGE分离后，5%BSA封闭，加入一抗 GRP78（1∶1 000），ATF4（1∶1 000），Cx43（1∶1 000），4℃孵育过夜后，二抗孵育1 h。ECL显影检测小鼠心肌细胞GRP78与ATF4和Cx43表达。。

1.6 统计学方法

实验结果以均数 ±标准差（±s）表示，采用SSPS11.5统计分析软件进行数据分析，两组间均数比较采用 t检验。

2 结果

2.1 各组小鼠精神、饮食、活动、毛色及死亡数量的变化

对照组小鼠毛发光亮，体质量随时间增加，病毒性心肌炎组小鼠毛发灰暗，躁动不安，体质量明显减轻，不喜饮食，黄芪总黄酮组小鼠体重有所减轻，饮食略差，3组小鼠饲养及实验过程中均未出现死亡。

2.2 各组小鼠心电图的变化

对照组小鼠心电图未见明显异常；病毒性心肌炎组小鼠极易出现心率失常，以室性早搏、短阵室速为主，黄芪总黄酮小鼠出现心律失常较模型组减少，并以室早为主（图1）。

Fig.1 Changes of electrocardiogramwere analyzed in three groups

2.3 光镜下心肌组织的变化

HE染色显示：病毒性心肌炎组小鼠出现心肌纤维排列紊乱，心肌间质明显水肿，大量淋巴细胞浸润，黄芪总黄酮组小鼠心肌纤维排列尚可，无间质水肿，有少量淋巴细胞浸润（图2）。

Fig.2 Pathological changes of cardiac tissues derived from different treatment group（HE×40）

2.4 Western blot检测各组小鼠心肌细胞GRP78、ATF4及Cx43表达的变化

与正常对照组比较，病毒性心肌炎组小鼠，GRP78、ATF4表达明显增高，Cx43表达明显减少（P＜0.01），黄芪总黄酮组小鼠心肌细胞 GRP78、ATF4表达明显减少（P＜0.01），Cx43表达明显增加（P＜0.01，图 3，表 1）。

Tab.1 Expression changes of GRP78，ATF4 and Cx43 in cardiac tissues of each group（±s，n＝12）

Tab.1 Expression changes of GRP78，ATF4 and Cx43 in cardiac tissues of each group（±s，n＝12）

GRP78：Glucose-regulated protein 78；ATF4：Activating transcription factor 4；Cx43：Connexin 43**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs viral myocarditis group

Group GRP78 ATF4 Cx43 Control 467±41 1011±93 1402±128 Viral myocarditis 1593±148**2248±189**300±37**Total flavonoids 981±87##1734±156##864±75##

Fig.3 Protein expression of GRP78，ATF4 and Cx43 in mice heart of each group

3 讨论

本实验发现病毒性心肌炎组小鼠出现严重心律失常，而TFA组小鼠心律失常明显减少，这与本实验室前期研究结果相吻合［3］。上述实验结果说明TFA具有明显抗心律失常作用。本实验室在以往工作中发现TFA具有明确的缓解内质网应激作用［8-10］，但这种缓解内质网应激作用在减少病毒性心肌炎引起的心肌细胞凋亡作用明显，是否通过缓解内质网应激实现抗心律失常还不十分明确。为此又对各组小鼠心肌细胞检测了内质网应激伴侣蛋白

GRP78，内质网应激信号通路因子ATF4及缝隙连接蛋白Cx43表达，发现TFA具有抑制GRP78，ATF4表达，增加Cx43表达作用。因此根据本实验结果推测黄芪总黄酮可能通过缓解内质网应激及抑制内质网应激信号通路因子活化，增加Cx43表达来实现其抗心律失常作用的，至于这种作用是否还有别的内质网应激信号通路因子参与，凋亡是否在其发挥作用，还需要在以后的实验中证明。

【参考文献】

［1］ 黄 侠，于 影，赵 明.病毒性心肌炎与细胞凋亡、缝隙连接蛋白的研究进展［J］.临床心血管病杂志，2016，32（7）：742-744.

［2］ 刘 磊，王洪军，辛 晴，等.病毒性心肌炎所致小鼠心力衰竭心肌组织内质网应激相关的凋亡关系的研究［J］.中国应用生理学杂志，2014，30（4）：465-468.

［3］ 赵 明，戈宏焱，陈少青，等.黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心律失常的作用［J］.中国心血管病研究，2012，10（2）：149-151.

［4］ 巴金华，窦忠霞，柳文清，等.黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞内向整流钾电流的作用［J］.中国分子心脏病学杂志，2013，13（1）：412-414.

［5］ 宣丽颖，陶谢鑫，赵雅君，等.黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染乳鼠心肌细胞内质网应激、Calumenin蛋白及缝隙连接蛋白Cx43的作用［J］.中国应用生理学杂志，2016，32（1）：51-54.

［6］ 于 影，马奎影，侯春霞，等.黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒所致病毒性心肌炎小鼠急性期心肌组织连接蛋白 43 mRNA表达的影响［J］.成都医学院学报，2013，8（5）：548-550.

［7］ 周晓敏，柴 花，王伊林，等.黄芪总黄酮对病毒性心肌炎小鼠心室肌细胞单通道钙电流的影响［J］.中国应用生理学杂志，2015，31（1）：58-60.

［8］ 牛晓峰，赵雅君，陶谢鑫，等.黄芪总黄酮通过抑制内质网应激对小鼠病毒性心肌炎保护作用的实验研究［J］.临床心血管病杂志，2015，31（2）：129-132.

［9］ 周晓敏，陶谢鑫，杨 洋，等.黄芪总黄酮与丹参酮ⅡA磺酸钠对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞内质网伴侣蛋白及L-型钙通道表达的作用［J］.临床心血管病杂志，2015，31（3）：254-256.

［10］王洪军，于 淼，王云鹤，等.黄芪总黄酮对柯萨奇B3病毒感染心肌细胞内质网应激及促凋亡信号因子作用［J］.临床心血管病杂志，2016，32（1）：70-73.