利用双标准曲线法检测刺萼龙葵SrDOG1基因的表达

王新果　赵丹丹　黄红娟　黄兆峰　陈景超　王慧敏　张朝贤　魏守辉

摘要

双标准曲线法是基因表达定量研究中应用较广的一种相对定量检测方法。本研究结合绝对定量的原理，对传统双标准曲线法进行了改进。以刺萼龙葵延迟萌发基因DELAY OF GERMINATION 1 （DOG1）的表达检测为例，选择βactin为内参基因，分别将目的基因和内参基因片段插入pEASYBlunt Zero载体，制作标准质粒。提取冷藏或常温储藏种子的RNA进行荧光扩增，同时将标准质粒梯度稀释液作为模板构建标准曲线，以此计算SrDOG1的相对表达量。结果表明，双标准曲线法能够灵敏地检测SrDOG1基因的差异表达，发现冷藏种子中SrDOG1基因的表达量较常温储藏显著增高。双标准曲线法检测结果稳定，重现性好，数据处理简单，适用于多种条件下基因表达水平的比较，为进一步系统研究刺萼龙葵DOG1基因的表达特性和基因功能奠定了基础。

关键词

双标准曲线法； 刺萼龙葵； DOG1基因； 相对定量； 表达检测

中图分类号：

Q786

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017119

Detection of DOG1 gene expression in Solanum rostratum by

double standard curve method

WANG Xinguo， ZHAO Dandan， HUANG Hongjuan， HUANG Zhaofeng，

CHEN Jingchao， WANG Huimin， ZHANG Chaoxian， WEI Shouhui

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Double standard curve method is a relative quantification method widely used in quantitative detection of gene expressions. Combined with the principle and method of absolute quantification， the traditional double standard curve method was improved. The fragment of target gene DELAY OF GERMINATION 1 （SrDOG1） and reference gene βactin （SrACT） were cloned into pEASYBlunt Zero vector to make the standard plasmid， respectively. The total RNA were extracted from Solanum rostratum seeds and the standard curves were achieved by realtime PCR reaction using the dilutions of standard plasmid as the template. According to the standard curve， the relative expression of SrDOG1 was obtained. The results showed that SrDOG1 transcript level in seeds under cold storage was significantly higher than that under room temperature， suggesting that double standard curve method has high sensitivity in quantification of expression differences of DOG1 gene. This method is stable， reproducible and simple in data processing. It is suitable for the comparison of relative gene expression levels under various conditions and is useful to further determine the gene expression and gene function of SrDOG1 in the future.

Key words

double standard curve； Solanum rostratum； DOG1； relative quantification； expression detection

基因表達水平的检测方法大致可分为绝对定量和相对定量两类[14]。绝对定量是样本中某基因的具体表达量，而相对定量是相对某一参照的表达水平。相对定量又分为2-ΔΔCT法和双标准曲线法[510]。相较于2-ΔΔCT法，双标准曲线法计算简单，对引物的扩增效率没有严格的要求。但传统的双标准曲线法得到的目的基因相对于内参基因的表达量并不能反映样本中真实的表达水平，必须设定对照组，结果表示为未知样本相对于对照样本表达量的倍数[1112]。因此，在处理较多的试验中，可能由于无法选择相同的对照组而导致无法对不同处理的结果进行比较。通过结合绝对定量的方法及原理，对传统的双标准曲线法严格规范，可无需设定对照组，直接检测未知样本中目的基因相对内参基因的真实表达水平，能够更加直观地得出多个处理之间的表达差异。

刺萼龙葵Solanum rostratum Dunal是一年生茄科茄属入侵杂草，是一种高度危险的检疫性有害生物，严重影响其入侵地的生态多样性[1315]。刺萼龙葵具有极强的入侵性，我国已先后在辽宁、吉林、河北、北京、山西、内蒙古及新疆等地发现其扩散蔓延[1618]。刺萼龙葵主要由种子进行传播，降低刺萼龙葵种源基数，可以有效地控制其危害蔓延[1920]。刺萼龙葵种子具有极强的休眠特性，而DOG1（DELAY OF GERMINATION 1）基因是種子休眠特异相关基因[2122]。建立稳定、可靠的刺萼龙葵DOG1基因表达的定量检测方法，有利于今后深入研究SrDOG1基因的时空表达特性和基因功能。

1 材料与方法

1.1 引物设计

以βactin基因为内参基因，根据刺萼龙葵SrDOG1和βactin（SrACT）基因序列，采用Oligo 7与Primer 6等软件分别设计用于克隆及荧光定量PCR的引物，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。具体引物序列见表1。

1.2 质粒标准品的制备

分别扩增目的基因和内参基因片段，产物纯化回收后连接至pEASYBlunt Zero载体，并转入大肠杆菌中扩繁，之后使用菌液PCR进行验证，筛选出的阳性克隆送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。分析测序结果，从测序合格的菌液中提取质粒并纯化，凝胶电泳及微量紫外分光光度计检测质粒的纯度和浓度。合格的质粒溶液OD260/OD280在1.8左右，OD260/OD230在2.2左右。根据质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×质粒浓度（g/μL）/质粒分子量（g/mol）得出各质粒拷贝数浓度，之后稀释拷贝数浓度至107 copies/μL左右作为荧光定量PCR反应的模板[2124]。

1.3 RNA的提取及反转录

分别取25～35粒常温储藏和冷藏的刺萼龙葵种子，参考植物总RNA提取试剂盒的操作步骤，提取种子总RNA，经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计检测合格后，使用反转录试剂盒合成cDNA备用。合格的RNA在电泳胶图中应无DNA杂带，OD260/OD280在1.8～2.0之间，OD260/OD230在2.0以上。

1.4 引物及质粒标准品扩增效率的荧光验证

引物验证以cDNA为模板，将其进行3倍梯度稀释后进行荧光定量PCR，得到目的基因与内参基因荧光引物的标准曲线，结合标准曲线的扩增效率、决定系数以及熔解曲线，确定荧光引物的可用性。荧光PCR反应体系：SYBR Green I荧光染料12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，补ddH2O至25 μL。荧光定量PCR反应条件：95℃ 15 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环；从60℃连续递增到 95℃，收集荧光信号获取熔解曲线，以确定 PCR反应的特异性。每个梯度的样品在同一个96孔板上做3次技术重复，并用无菌水代替模板作为对照。质粒标准品的验证过程同引物基本一致，仅模板不同，模板更改为梯度稀释的质粒。两次检测的扩增效率均需达90%～110%，决定系数0.990以上。

1.5 基因表达检测方法及数据处理

将含有目的基因和内参基因的质粒标准品与待测样本（常温储藏和冷藏的种子总RNA）在同一96孔板上进行实时荧光定量PCR反应制作标准曲线，质粒标准品进行3倍梯度稀释作为定量反应模板。未知样本分别检测目的及内参基因的表达水平，每个样本设3个生物学重复，每个处理设3个技术重复，以无菌水为对照。根据目的和内参基因质粒标准品构建的标准曲线获取基因的拷贝数含量，通过内参基因的均一化处理，即可知未知样本中目的基因相对于内参基因的表达量。数据使用SPSS软件进行方差分析（邓肯法，α=0.05）。

2 结果与分析

2.1 质粒提取及浓度检测

经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，目的及内参基因质粒的提取较为完整，无杂质条带（图1），且各质粒溶液浓度较高，OD260/OD280均在1.8～2.0之间，OD260/OD230基本大于2.0（表2）。可作为标准品构建标准曲线。

2.2 引物及质粒标准品的荧光检测

通过梯度荧光定量PCR，利用软件分析，得到引物在以cDNA为模板时的标准曲线以及熔解曲线（图2）。结果表明，试验设计的引物均较为理想，SrDOG1引物的扩增效率为104.78%，决定系数为0.997，熔解曲线单峰，无非特异性产物；SrACT引物的扩增效率为100.13%，决定系数为0.999，熔解曲线单峰，无非特异性产物。

使用同样的方法，可得目的基因及内参基因质粒标准品的标准曲线及熔解曲线（图3）。目的基因质粒标准品的扩增效率为103.87%，决定系数为0.999，内参基因质粒标准品的扩增效率为96.23%，决定系数为0.999。各质粒的熔解曲线均为单峰，反应均无非特异性产物。

2.3 SrDOG1基因的表达量检测

分别测定刺萼龙葵种子在常温和低温储藏条件下SrDOG1基因的相对表达量，结果表明，低温贮藏条件下种子中SrDOG1基因的表达水平是常温贮藏条件下的2.28倍，两者间差异达到显著水平（图4）。这一结果与前人对DOG1基因的表达特性研究较为一致，说明双标准曲线法可以检测出SrDOG1基因在不同条件下的表达差异。从具体检测数据上看，低温条件下SrDOG1基因的表达量是内参基因SrACT的0.919倍，数据标准误为0.122、变异系数为22.9%，在置信度0.95下其置信区间为0.680～1.157；而在常温储藏条件下，SrDOG1基因的表达量是SrACT的0.403倍，标准误为0.040、变异系数为17.4%，在置信度为0.95下其置信区间为0.323～0.482。上述结果表明，双标准曲线法检测稳定性强、重复性好，结果较为可靠，检测精度较高，适用于刺萼龙葵SrDOG1基因表达水平的检测。

3 討论

实时荧光定量是一种特异性强、灵敏度高、重复性好的核酸定量分析技术，具有快速、准确、简便等优点[2527]。对于处理较多的研究，传统荧光定量由于参照设置的差异而难以对结果进行不同维度的比较。双标准曲线法的相对定量检测通过优化绝对定量的方法，对引物、质粒标准品、标准曲线等进行严格规范，基因表达水平可以简单地以目的基因为内参基因的倍数表示，因而能够比较多处理间目的基因的表达水平差异[22，28]。

应用双标准曲线法对刺萼龙葵种子中延迟萌发基因DOG1的表达进行了检测，结果显示，该方法检测结果稳定、直观、重现性好，数据对比方便快捷，可以灵敏地检测出DOG1基因在不同条件下的表达差异，为进一步研究DOG1基因的表达特性及功能奠定了方法基础。

DOG1基因是调控种子休眠的特异相关基因，通常在发育或成熟的种子中表达[2122]。种子的休眠程度与DOG1蛋白水平高度相关，DOG1的表达水平越高，种子休眠程度越深，DOG1的表达水平可以反映种子的休眠程度[1]。本研究检测发现，刺萼龙葵低温储藏种子中DOG1基因的相对表达量几乎是常温储藏条件下的两倍，说明低温环境对DOG1基因的表达及种子休眠有显著影响。前人也认为DOG1基因可能是种子的环境信号感受器，可通过感知温度、水分或光照等环境信号，使种子在不同季节对环境做出不同的响应，调控开启种子萌发的适宜时间窗口[22，2930]。

杂草种子休眠的进化趋势是将种子萌发延迟到适于幼苗生长的季节，萌发时机的调节是杂草适应自然和农业生态系统的重要性状。目前，延迟萌发基因DOG1的具体功能和调控通路尚不明确，通过建立双标准曲线法的荧光定量检测技术，系统研究DOG1基因的表达特性和时空特征、季节性休眠过程中种子萌发与DOG1基因表达水平的相关性、DOG1基因对环境因子信号的响应模式及与ABA和GA等激素信号通路的互作机理，有望深入揭示DOG1基因调控种子休眠的分子机制。

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（责任编辑：杨明丽）