黏虫咽侧体抑制神经肽基因克隆与成虫期表达模式分析

程李莉 江幸福 程云霞 刘悦秋 张蕾 罗礼智

摘要

为明确黏虫咽侧体抑制神经肽基因（allatostatin， AST）在调控黏虫Mythimna separata （Walker） 保幼激素（juvenile hormone， JH）中的功能，采用RTPCR和RACE技术克隆获得的黏虫AST基因cDNA全长序列902 bp，开放阅读框378 bp，编码125个氨基酸。蛋白分子量为14.33 kD，等电点为9.25，具有C型AST典型的PISCF序列。进化树分析表明，黏虫AST氨基酸序列与一点黏虫、草地贪夜蛾、棉铃虫氨基酸序列相似性高达80%以上。实时荧光定量PCR结果表明AST在成虫期的表达有明显组织和时间特异性。AST在飞行肌中表达量最高，头部其次，卵巢最低；黏虫头部AST表达量在7日龄最高，飞行肌中AST基因的表达量在1日龄最高。本研究对进一步揭示黏虫AST基因对JH调控作用，明确黏虫JH调控迁飞和生殖的相关的分子调控机制具有重要意义。

关键词

黏虫； 咽侧体抑制素； 克隆； 表达

中图分类号：

Q 965

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017179

Cloning and expression analysis of allatostatin gene in adults of the

oriental armyworm， Mythimna separata （Walker）

CHENG Lili1， JIANG Xingfu1， CHENG Yunxia1， LIU Yueqiu2， ZHANG Lei1， LUO Lizhi1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China； 2. Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

In order to clarify the role of the allatostatin gene （AST） in the process of juvenile hormone synthesis and release of Mythimna separata （Walker）， the AST gene of M.separata was cloned by RTPCR and RACE.The full length of cDNA was 902 bp， which contained a 378 bp open reading frame （ORF） encoding 125 amino acid residues with a molecular mass of 14.33 kD and a theoretical isoelectric point of 9.25. The typical structure of Ctype AST （PISCF） was located in the deduced amino acid sequence. Phylogenetic analysis indicated that AST protein of M.separata had a high similarity （up to 80%） to those of Pseudaletia unipuncta， Spodoptera frugiperda and Helicoverpa armigera. The qRTPCR analysis showed that the expression levels of AST gene were significantly different at different stages and in various tissues of the female M.separata， mostly expressed in flight muscle and head， weakly expressed in the ovary. The expression was the highest in the head at 7 d but in flight muscle at 1 d. This study has a significance in enriching our knowledge about the function of AST on JH and the molecular mechanism of JH during flight and reproduction in M.separata.

Key words

Mythimna separata； allatostatin； cloning； expression

保幼激素（juvenile hormone， JH）是一种由昆虫咽侧体所分泌的倍半萜类化合物，对昆虫的变态、生殖和发育起到重要的调控作用。在幼虫期，阻止蜕皮激素引起的变态，维持幼虫的结构特征，成虫期能促进卵子的发生、卵巢的发育和成熟[12]。研究表明，昆虫体内的JH受合成和代谢两种途径控制。其中，咽侧体（corpora allata， CA）合成JH的活性受脑神经细胞产生的神经肽调控[3]，分别是促进咽侧体分泌保幼激素的促咽侧体神经肽（allatotropin， AT）和抑制咽侧体活性的AST （allatostatin， AST）[46]。AST由脑神经细胞分泌，通过神经、体液途徑传递到咽侧体抑制保幼激素的合成与释放[7]，AST对咽侧体的抑制作用与昆虫种类、发育阶段有关。体外合成的AST多肽可以抑制鳞翅目昆虫烟芽夜蛾Heliothis virescens的咽侧体合成保幼激素，而对不完全变态昆虫血黑蝗Melanoplus sanguinipes无影响[8]；烟芽夜蛾羽化后24 h雌成虫的AST多肽显著抑制羽化后3 d的雌成虫咽侧体合成保幼激素的能力[9]。但AST在昆虫中的功能还不仅限于此，太平洋折翅蠊Diploptera punctata中肠中的AST可以刺激中肠酶的活性，后肠中的AST与其调节促肌蛋白的合成有关[10]。

目前，已分离鉴定出AST的昆虫有家蚕、小菜蛾、黑脉金斑蝶、草地贪夜蛾、水稻二化螟等，按照其氨基酸序列碳端不同结构可以将AST分为3类：（1）A型碳末端有同一酰胺化氨基酸序列Y/FXFGL[11]；（2）B型碳末端有一个酰胺化的W（X）序列[1213]；（3）C型碳末端氨基酸未经酰胺化[14]，该型咽侧体抑制素N末端具有环化阻碍结构，C末端含有未环化的PISCF序列，且在两个内部的半胱氨酸之间有1个二硫桥[15]。

黏虫Mythimna separata （Walker）属鳞翅目，夜蛾科，是一种典型的长距离迁飞害虫。主要在亚洲、大洋洲近30个国家发生为害，我国除新疆外均有分布。黏虫的寄主种类达16科100多种，除为害禾本科作物和牧草外，还给经济和油料作物造成重大损失。建国后我国黏虫多次暴发成灾，1950-1989年全国性黏虫暴发成灾17年，成灾面积7 191万hm2，造成粮食损失1 600多万t[16]。2012年，三代黏虫在东北等地大面积暴发成灾，发生927.99万hm2，损失粮食65.79万t。前期研究发现，保幼激素对黏虫的迁飞、生殖和发育具有重要调控作用。黏虫成虫迁飞时保幼激素和卵巢发育水平较低，保幼激素水平升高后卵巢成熟，飞行能力下降，且黏虫迁入种群表现为保幼激素水平高，卵巢发育级别高，飞行能力较弱[1718]；黏虫点滴保幼激素后飞行能力减弱，而生殖能力增强[19]；羽化后1日龄是保幼激素调控迁飞和生殖的关键期，黏虫1日龄飞行可以刺激咽侧体活性促进保幼激素的合成与释放[20]，对1日龄黏虫进行饥饿处理使得其保幼激素提前分泌，促进卵巢发育[2122]。由此可见，保幼激素和黏虫的迁飞与生殖密切关联，而与保幼激素相关的分子调控途径的研究将为揭示黏虫迁飞致灾的调控机制奠定基础。为了进一步明确保幼激素在调控黏虫迁飞和生殖中的分子调控途径，本研究对调控保幼激素合成的黏虫AST基因开展研究。通过利用RACE技术克隆得到黏虫AST基因全长，实时荧光定量技术分析其在黏虫体内的时空表达情况，对进一步研究保幼激素调控黏虫飞行与生殖的内在分子调控机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：虫源来自田间采集的越冬代黏虫成虫，经室内繁殖3、4代供试。幼虫用30～50 cm长的玉米叶饲养，饲养密度为10头/瓶，温度为（24±1）℃，光周期为L∥D=14 h∥10 h，相对湿度为70%左右。饲养方法参照吕伟祥等[23]的室内人工饲养方法，每日更换新鲜玉米叶，直至幼虫停止取食为止。幼虫老熟时，在玻璃瓶内加入含水量10%～15%的土粒供其化蛹。成虫羽化后雌雄配对放置于直径8 cm，高20 cm的塑料罩中并喂饲5%的新鲜蜂蜜水，每日更换。

主要试剂：RNA提取试剂TRIzol Reagent购于美国Invitrogen公司、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、DNA连接试剂盒、5′Full RACE Kit试剂盒购于TaKaRa公司、FastQuant RT Kit （with gDNase）反转录试剂盒、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）实时荧光定量试剂盒购于北京天根生化科技有限公司。所有引物合成与DNA测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。大肠杆菌感受态细胞JM109购于TaKaRa公司、克隆载体pMD20T购于天为时代公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設计与合成

根据黏虫近缘种一点黏虫Pseudaletia unipuncta基因序列，GenBank序列号为U36570.1，参照保守区域结合PCR引物设计原则，设计简并引物，根据同源序列设计3′RACE引物和5′RACE引物，扩增得到基因的3′端序列和5′端序列。由得到的黏虫AST序列，设计1对荧光定量引物ASTqF/ASTqR，以βactin基因[24]（登录号：GQ856238.1）作为内参基因（表1）。

1.2.2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

解剖黏虫成虫脑组织、飞行肌、卵巢置于无RNA酶离心管中，用液氮冷冻后用Trizol提取各组织RNA后溶于DEPC水，RNA用核酸蛋白检测仪检测其浓度和纯度，用1.5%琼脂糖凝胶检测其完整性，参照FastQuant RT Kit （with gDNase）反转录试剂盒说明书合成cDNA第一链，并保存于-80℃以备使用。

1.2.3 黏虫AST基因全长cDNA序列克隆及重组质粒构建

以获得的cDNA产物为模板，利用上述设计的引物（CTE579 F、CTE579 R）扩增同源序列；由上述得到的同源序列，结合3′RACE引物设计原则设计引物（CTE605 3′），和5′RACE引物设计原则设计引物（CTE605 5′），分别克隆获得基因的3′和5′端序列。PCR反应程序设置为：94℃预变性3 min；然后30个循环，循环条件为94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s；最后72℃延伸10 min。

上述各PCR扩增片段进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后使用连接酶与pMD20T载体连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。蓝白斑筛选，挑选阳性菌落，提取质粒并测序。然后将所得序列片段拼接得到cDNA全长序列。由所得cDNA序列设计引物（CTE605 F、CTE605 R）进行PCR扩增，用于验证开放阅读框。

1.2.4 AST基因序列分析与系统进化树构建

利用ORF Finder （http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）查找完整的开放阅读框，并推导出相应的氨基酸序列。利用NCBI Blastx进行氨基酸序列相似性搜索。使用在线软件SignalP4.1 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测。序列比对使用DNAMAN软件；利用ClustalX软件进行氨基酸序列多重比较，采用MEGA 5.0邻位相接法（neighbor joining， NJ）进行1 000次重复分析构建系统进化树。

1.2.5 实时荧光定量PCR反应

以1、3、5和7日龄黏虫雌蛾的头部、飞行肌、卵巢的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR技术检测羽化后不同时间各组织内AST的表达水平，以1日龄头部的表达量为参照，每个处理分别设置4个生物学重复。

实时荧光定量采用SYBR Green法，20 μL体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL；50×ROX Reference Dye 0.4 μL；cDNA模板2 μL；加ddH2O补齐至20 μL。该反应在ABI 7500 Realtime PCR仪中进行；反应条件设置为：95℃预变性15 min；然后40个循环，循环条件为95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸32 s。

1.2.6 数据统计与分析

黏虫AST基因在不同发育阶段和组织的转录水平利用2-△△Ct法分析，不同发育阶段和组织AST的相对表达量采用SAS 5.0软件进行Oneway ANOVA方差分析，多重比较采用Tukeys HSD法，差异显著性检验水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 黏虫AST片段的克隆与序列分析

2.1.1 黏虫AST片段的克隆

以黏虫脑组织cDNA为模板，扩增得到一条特异性同源序列条带，通过3′RACE和5′RACE反应分别得到长度为388 bp的3′端和224 bp的5′端，该基因被命名为黏虫AST基因，GenBank登录号为JQ669383.1。

2.1.2 黏虫AST基因序列分析

AST基因cDNA序列全长共902 bp，并具有真核生物典型的polyA加尾信号AATAAA。该基因开放阅读框为378 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，共编码125个氨基酸。预测的蛋白分子量为14.33 kD，等电点为9.25，N末端含有1个由26个氨基酸组成的信号肽，属于C型咽侧体抑制素，含有保守的未环化C末端PISCF，内部包含两个半胱氨酸可以形成稳定的二硫桥结构，含有1个蛋白激酶磷酸化位点（TIR23-25）。对比AST编码区cDNA的序列，其同源性经过NCBI上BLAST分析，与一点黏虫Pseudaletia unipuncta（GenBank登录号：U36570.1）同源性达95%，和棉铃虫Helicoverpa armigera（GenBank登录号：KC340915.1）同源性达87%，与脐橙螟蛾Amyelois transitella（GenBank登录号：XM_013331392.1）和柑橘凤蝶Papilio xuthus（GenBank登录号：XM_013309172.1）的同源性达77%以上，比对结果证明该基因为黏虫AST基因。

2.2 氨基酸序列相似性及进化树分析

推导得到的黏虫AST（GenBank登录号： AFI56408.1）编码的氨基酸序列与其他昆虫氨基酸序列比对结果表明，该氨基酸序列与一点黏虫（GenBank登录号：AAA93257.1）氨基酸序列的一致性最高，达到99.2%；与棉铃虫（GenBank登录号：AGH25547.1）、草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda （GenBank登录号：Q868F8.1）、二化螟Chilo suppressalis （GenBank登录号：ALM30301.1）具有较高的序列一致性，分别为87.2%、85.6%、61.6%；与家蚕Bombyx mori （GenBank登录号：NP_001124356.1）和小菜蛾Plutella xylostella （GenBank登录号：XP_011549721.1）的序列一致性较低，分别为52.8%和44.8%（图3）。序列比对分析结果表明，C型AST普遍存在于鳞翅目昆虫中，不同昆虫AST氨基酸序列存在共同保守区域PISCF，并且两个半胱氨酸形成了AST中唯一一对链内二硫键。

进化树分析显示，黏虫AST基因与一点黏虫的亲缘关系最近，与棉铃虫、草地贪夜蛾、分月扇舟蛾Clostera anastomosis （AEM44668.1）的亲缘关系较近，与玉带凤蝶Papilio polytes （XP_013145137.1； XP_013145138.1）、柑橘凤蝶（XP_013164626.1）、黑脉金斑蝶Danaus plexippus （EHJ74863.1）、脐橙螟蛾（XP_013186846.1）、小菜蛾、家蠶、二化螟的亲缘关系较远，而与埃及伊蚊Aedes albopictus（JAC07495.1）、拟果蝇Drosophila simulans （GenBank登录号：XP_016024602.1）、冬尺蠖Operophtera brumata （KOB78759.1）的亲缘关系最远（图4），总体趋势是亲缘关系越近，同源性越高，与氨基酸序列比对结果基本一致。

2.3 黏虫AST基因的时序差异性表达

采用实时荧光定量PCR，从羽化后1～7日龄黏虫的头、飞行肌和卵巢中均检测到AST基因的表达，但其表达情况随组织和发育时间的不同而有明显的差异。整体而言，AST在组织中的表达情况为飞行肌>头部>卵巢。首先，黏虫AST基因的表达具有明显的组织分布表达特异性（F2，9=26.53，P<0.01；F2，8=62.55，P<0.01；F2，9=112.14，P<0.01）。

在羽化后1、3、5龄黏虫飞行肌中AST的表达量均显著高于头部和卵巢（P<0.05），但头部和卵巢之间无显著性差异（P>0.05）。羽化后7日龄飞行肌AST基因的表达量显著高于卵巢和头部的表达量，且头部表达量也显著高于卵巢AST的表达（F2，9=13.48， P<0.01）。其次，黏虫头部AST基因在羽化后不同时间内的表达量差异显著（F3，11=4.53， P<0.05）；羽化后7日龄头部的相对表达量最高且显著高于羽化后5日龄（P<0.05），但和其他日龄差异不显著（P>0.05）。羽化后不同日龄飞行肌中AST基因的表达量也存在显著性差异（F3，12=9.63， P<0.01），羽化后1日龄AST基因的表达量最高，显著高于羽化后5日龄和7日龄（P<0.05），但和羽化后3日龄差异不显著（P>0.05）；卵巢中AST基因的表达量较低，且不同日龄之间的表达量无显著性差异（F3，12=0.49， P>0.05）。

3 讨论

AST是昆虫体内重要神经肽激素，与昆虫咽侧体合成释放保幼激素的活性密切相关[25]，除此之外还参与昆虫体内能源物质的积累以及中肠的蠕动等生命活动。本研究通过RTPCR和RACE技术从黏虫的脑部克隆获得AST基因全长序列，并预测其蛋白分子量为14.33 kD，等电点为9.25，N末端含有1个由26个氨基酸组成的信号肽，该基因属于C型AST，含有保守的未环化C末端PISCF，氨基酸序列内部的两个半胱氨酸可以形成稳定的二硫桥结构。NCBI BLAST分析结果表明该基因核酸序列与一点黏虫、棉铃虫、脐橙螟蛾、柑橘凤蝶的相似性达80%以上，亲缘关系高度接近。由该基因序列推导的氨基酸序列，经进化树分析与一点黏虫、棉铃虫、草地贪夜蛾亲缘关系最近，氨基酸序列比对结果显示高度同源，达到85%以上。以上结果表明本试验克隆获得的黏虫AST基因属于昆虫AST基因家族成员之一。

实时荧光定量PCR结果显示：AST广泛存在于黏虫的各种组织中，包括脑、飞行肌、卵巢，但是其在不同发育时期和不同组织的表达量不同。羽化后1～5 d AST在头部的表达量较低，7 d时出现升高，且与1、3、5 d有显著性差异。研究表明迁飞型黏虫一般在羽化后第5天开始产卵[26]，因此羽化后1～5 d是黏虫卵巢发育与卵黄原蛋白形成时期，此时期AST的表达量较低；羽化后第7天黏虫卵巢发育成熟产卵行为发生后，AST在黏虫头部的表达量上升，且显著高于产卵前期时的表达量，推测黏虫头部AST基因的表达量变化与其生殖周期有关，这与AST在太平洋折翅蠊中的表达类似[27]。有关研究表明黏虫羽化后1～5 d时咽侧体活性呈上升趋势，并于羽化后第5天出现最大值后下降[20]；黏虫羽化后血淋巴内保幼激素滴度与头部AT表达量变化一致，羽化初期黏虫头部AT的表达量和保幼激素滴度较低，随着羽化后时间的增加AT的表达量和保幼激素Ⅱ滴度呈上升状态，并于羽化后第5天出现最大值[28]后呈下降趋势，黏虫头部AT基因的表达量、咽侧体活性和保幼激素滴度的变化均与头部AST基因的表达量变化相反。由此推测：黏虫羽化后1～5 d，头部AT表达量较高而AST表达量较低，刺激了咽侧体活性，促进保幼激素的合成与释放，致使体内保幼激素滴度较高，利于生殖系统发育和卵黄原蛋白的合成，卵母细胞吸收卵黄原蛋白，以及卵母细胞的成熟[2]；黏虫羽化后第7天产卵后，生殖系统对于保幼激素的需求量较低，自身通过升高AST的表达量，同时降低AT的表达量，抑制咽侧体释放保幼激素的活性，致使体内保幼激素滴度降低。以上研究表明黏虫可以根据自身发育需要通过调节关键基因的表达量来调控保幼激素水平，从而达到维持影响迁飞和生殖的目的。

飞行肌中AST在黏虫羽化初期表达水平最高，随着羽化时间呈下降趋势。羽化初期黏虫处于幼嫩期，飞行系统尚未发育成熟时飞行肌中AST的表达量较高，随着发育时间，黏虫飞行能力逐渐增强飞行肌中AST的表达量保持较低水平，AST的表达量与飞行能力呈一定负相关，推测飞行肌中AST可能参与抑制黏虫的飞行。曾有研究指出AST可以抑制太平洋折翅蠊肌肉的收缩[29]，AST是否参与抑制黏虫飞行肌肌肉收缩还有待进一步研究。AST的广泛分布反映了其功能的多样性，但是目前仅探究了AST在头部、中肠、后肠的功能，而本试验中黏虫的空间表达结果表明黏虫内主要表达部位是头部和飞行肌，卵巢中的表达相对较少，且试验所选4个日龄飞行肌中的表达量均远远高于头部和卵巢，亟须进一步探究AST在黏虫飞行肌的功能。

本研究克隆得到了黏虫AST基因cDNA序列全长，分析明确了该基因的序列特征，并从mRNA水平检测了该基因在黏虫雌蛾体内的时空表达模式。该研究结果为利用RNAi技术进一步研究该基因的功能奠定了基础，丰富了影响黏虫迁飞和生殖的JH相关调控理论。

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（责任编辑：田 喆）