苍南地区前列腺癌与HPV16/18感染的相关性研究

黄兆浪 庄小艺 周炳同 温莉虹

高危型人乳头瘤病毒（HPV）持续感染是导致宫颈上皮内瘤变和宫颈癌产生的必要条件[1]，在高危型HPV中以HPV16/18感染最为常见，研究表明其至少占70%以上[2]。目前，文献中关于HPV16/18感染与男性生殖系统肿瘤的关系，特别是与前列腺癌（prostate cancer，PCa）的关系研究较少。本研究采用原位杂交方法检测PCa石蜡标本中HPV16/18感染情况，并与同期良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）作对照研究，同时采用免疫组化En Vision法检测上述患者p16的表达情况，留取患者的尿液和部分活检新鲜组织标本分别做尿液和电镜HPV检查，探讨HPV16/18感染与本地区PCa发生的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取本院2012至2016年PCa患者存档石蜡标本 64例（PCa组），年龄 57～95（77.1±7.9）岁。抽取同期BPH患者72例作对照研究（BPH组），年龄59～88（72.7±7.2）岁。其中2016年临床诊断为PCa的19例患者及BPH的27例患者同时留取尿液检测高危型HPV，10例PCa和7例BPH患者的活检新鲜组织标本电镜观测病毒样颗粒。上述检查结果均经2位高年资病理医师复阅确诊后选取。

1.2 方法

1.2.1 原位杂交方法检测HPV16/18感染情况 所有石蜡组织按如下程序进行：10%中性甲醛固定、石蜡包埋切片、脱蜡、酶处理、变性杂交、显色、复染等。所有标本均设阴性对照与阳性对照，最后以细胞核呈棕黄色颗粒为阳性，无着色为阴性。

1.2.2 免疫组化En Vision法检测p16表达情况 10%中性甲醛固定的组织经脱水、包埋、切片后按免疫组化说明书的步骤进行操作，设置阳性对照与阴性对照，再进行复染、中性树胶封固，最后光镜下观察。光镜下阳性为胞核呈棕黄色或胞核与胞质同时呈棕黄色，阴性为胞质单独着色或无着色。

1.2.3 尿液中高危型HPV的检测 采用第二代杂交捕获（HC2）法。留取患者清晨第一次前段尿液约10ml，置于15ml消毒带盖的离心试管中，经离心、DNA裂解、杂交捕获反应、冲洗、信号收集后在DML2000系统上进行结果判读，与标准阳性进行对照。检测样本的相对光单位（relative light unit，RLU），并且与标准阳性的 RLU 对比，如两者比值≥1.0，提示高危型HPV感染，如＜1.0为阴性。

1.2.4 电镜观测组织中的HPV 活检新鲜组织标本立刻投入2.5%戊二醛缓冲液中作前固定（温度4℃），然后改切为1mm 3小块、经缓冲液充分浸洗后、以1%四氧化饿溶液作后固定，采用超薄切片机切片、厚度50nm左右、醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，最后用国立H500透射电镜观察摄像。在细胞核内见到病毒样颗粒（在异染色质之间呈弥漫散布无明显结构或聚集成团呈假结晶状）为阳性，未见到者为阴性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者HPV或p16阳性率比较 PCa组石蜡标本中HPV16/18和p16阳性率均明显高于BPH组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；两组尿液中高危型HPV阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。HPV16/18和p16阳性表达情况见图1-2（插页）。

2.2 电镜观测所见 纳入电镜检查的10例PCa新鲜组织标本表现为细胞核大小不一，畸形或异形，核仁粗大，伴有双核仁或多核仁。胞质内形成大小不一、内含微绒毛的微囊，其中4例在细胞核内见到病毒样颗粒，表现为在异染色质之间呈弥漫散布无明显结构或聚集成团呈假结晶状，见图3。7例BPH新鲜组织标本电镜下胞质内富含致密体和溶酶体，核仁不明显，核大而不规则，未见病毒样颗粒。

表1 两组患者HPV或p16阳性率比较（%）

图3 电镜表现（a、b：白色箭头示HPV样颗粒在异染色质之间呈弥漫散布无明显结构或聚集成团呈假结晶状，透射电子显微镜，×30 000；M：核膜；N：核仁）

3 讨论

PCa是常见的男性恶性肿瘤，其发病率位居全球男性恶性肿瘤的第2位[3]。近年来我国发病率呈明显上升趋势，由2003年的6.53/10万上升至2009年的9.92/10万[4]。

PCa发病机制至今仍不明确。尽管雄激素及雄激素受体（AR）信号在前列腺腺体内环境的稳定和发育中是必要的，并且AR信号几乎驱动着所有PCa细胞的生长，但是雄激素和AR信号是否参与了PCa的发生和增殖的早期阶段，并没有定论[5]。有研究表明前列腺组织较易被潜在致瘤性的病毒感染，包括HPV、多瘤病毒和疱疹病毒等[6]。其中，HPV作为最重要的肿瘤相关性病毒之一，已被证实与多种肿瘤的发生、发展密切相关。现代研究已经证实HPV感染特别是高危型HPV持续感染是导致宫颈上皮内瘤变和宫颈癌产生的必要条件[1]，这其中又以HPV16/18感染最为常见，其至少占70%以上[2]。近年来分子生物学研究表明HPV16/18的E6/E7蛋白可使前列腺上皮细胞永生化[7]。

E6蛋白含151个氨基酸，包括2个锌指状结构Cys-x-x-Cys，E7 蛋白含 CR1、CR2、CR3 等 3 个功能区的磷酸化核蛋白，共有98个氨基酸[8]。E6/E7蛋白可分别结合、降解抑癌基因p53及Rb，致使细胞过度增殖和细胞周期调控失常，最终促使PCa的发生、发展[7]。

p16是一种多肿瘤抑癌基因，于1992年由Travis[9]在研究黑素瘤基因时首次发现，该基因位于染色体9p21，其中包含2个内含子和3个外显子。研究表明HPV一过性感染可能不会出现p16过表达，而持续感染可能使Rb基因与其致癌蛋白E7结合后失活，从而释放转录因子E2F，破坏p16的负向调节通路，最终导致肿瘤的发生[10]。

国外对PCa与HPV16/18感染的相关性研究报道的较多，如Carozzi等[11]运用PCR方法检测发现PCa患者中HPV16/18阳性表达明显高于BPH患者。国内这方面的研究少见报道。近年来，韦正树等[12]采用聚合酶链反应结合反向点杂交（PCR-RDB）技术检测了60例PCa患者和55例BPH患者前列腺组织中HPV16/18 DNA的表达情况，发现前者阳性率为36.7%（22/60），后者为9.1%（5/55），两组比较差异有统计学意义。本研究采用原位杂交的方法，结果表明PCa组HPV16/18阳性表达率为23.4%，BPH组为4.2%，两组比较差异有统计学意义；同时p16的免疫组化结果显示前者阳性率为25.0%，后者为8.3%，两组比较差异有统计学意义。上述结果提示HPV16/18感染可能与本地区PCa发病相关。本组送检的10例PCa新鲜组织电镜检测发现4例胞核内见病毒样颗粒，而7例BPH组织均未见病毒样颗粒，进一步提示PCa与HPV感染有关。

Zambrano等[13]研究发现PCa患者尿液中HPV DNA阳性率高，在其选取的12例PCa患者尿液组织中检测到6例HPV DNA阳性。本研究显示PCa组尿液中高危型HPV阳性率为47.4%，BPH组为18.5%，PCa组阳性率明显高于BPH组，可能与本地区自然环境、生活习惯等不同有关。

综上所述，本地区PCa与HPV16/18的感染存在相关性，HPV16/18的感染可能是本地区PCa的发病因素之一。本研究受条件所限，只针对高危型HPV16/18进行了检测，对其他类型HPV未进行相关检测，结果可能存在一定的误差，有待于今后进一步研究。

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