绝经期和生育期雌激素缺乏对小鼠免疫系统的影响

唐飞 徐娟 邵明君

21世纪人口老龄化对人类社会是一个重大的挑战，我国目前已步入老年型社会，相关老年疾病如骨质疏松症、心血管疾病、感染性疾病、尿失禁等严重影响绝经妇女的生活质量。随着2002年妇女健康倡议研究问世，有关激素治疗的临床应用与利弊分析再次成为世界各国关注的热点。众所周知，人类内分泌系统与免疫系统相互影响，雌激素（E2）通过影响细胞因子分泌而影响免疫功能[1]，然而有关绝经期细胞因子模式的详尽报道国内较少。本研究观察E2缺乏状态下年轻与老龄化小鼠之间是否存在免疫系统的差异，为进一步研究E2缺乏和免疫老化的关系提供实验依据，也为临床E2治疗对绝经妇女免疫功能的影响提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康雌性C57BL/6小鼠100只，鼠龄2月龄（75只）和10月龄（25只），由杭州师范大学动物实验中心提供。2月龄小鼠采用随机数字表法分为手术去卵巢组、药物去卵巢组和发情间期组，10月龄小鼠拟为自然绝经组，每组25只；其中手术去卵巢组、药物去卵巢组和自然绝经组为3组实验组，发情间期组为对照组。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作 （1）手术去卵巢组：每只小鼠腹腔注射3%戊巴比妥40mg/kg麻醉，经鼠背面切口切除双侧卵巢[2]；（2）药物去卵巢组：每只小鼠背部肌肉注射丙氨瑞林（安徽丰原制药股份有限公司，批号：20041904）100μg/（kg·d），连续3个月[3]；用药后20d逐只进行阴道脱落细胞涂片，显微镜下观察小鼠动情周期变化，1次/d，连续5d内不出现动情周期者为去势成功。（3）自然绝经组和对照组：无干预措施，普通级饲养。

1.2.2 小鼠发情间期和绝经期的判定 采用阴道细胞学检查，用小棉签蘸取少量0.9%氯化钠溶液，擦取小鼠阴道内分泌物顺时针涂在载玻片上晾干，用95%乙醇溶液固定，经HE染色后在10×10倍光镜下观察。若镜下见有大量白细胞及少量有核细胞为发情间期[4]，全部是无核角化细胞或间有少量上皮细胞为发情期；连续5d镜下观察阴道分泌物涂片，呈现不规则动情周期者为绝经期[5]。手术去卵巢组、药物去卵巢组于手术或使用药物后20d开始判定，自然绝经组和发情间期于3个月后开始判定，所有小鼠3个月后进行实验，实验前4h采用刀豆蛋白A（Con A）（10mg/kg）尾静脉注射直接诱导静息T细胞的活化、增殖和分化[6]。

1.2.3 各组血清免疫球蛋白（Ig）M、IgG、IgA和E2水平检测 实验采用断颈处死法取小鼠双眼眶静脉血，经2 325r/s离心后取出血清，置于-80℃低温冰箱保存送检，采用双抗体夹心ELISA法检测各组血清IgM、IgG、IgA和E2水平。待测样品孔加入样本40μl，然后各加入抗 E 抗体 10μl、链霉亲和素-HRP 50μl，盖上封板膜，轻轻震荡混匀，37℃温育60min；每孔加满洗涤液，重复洗涤3次；每孔加入显色剂100μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10min；最后每孔加终止液50μl终止反应，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD）值。

1.2.4 CD4/CD8比值检测 每管加入荧光抗体CD8a 2μl+CD4 2μl+CD3 5μl+CD45 2μl，加入小鼠全血（EDTA 抗凝）100μl，混匀。阴性对照管：仅全血 100μl，不加试剂。室温避光20min，加入1 000μl溶血剂，5min后1 500r/min离心5min，去除上清液。加入PBS缓冲液（血液分析仪鞘液）1 000μl，混匀，1 500r/min 离心 5min，去上清液，加入PBS缓冲液（血液分析仪鞘液）100μl，混匀。流式细胞分析仪设门，样本上机检测。

1.2.5 IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。取小鼠新鲜脾脏组织100mg，经液氮冰冻后Trizol法提取总RNA用以检测IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表达水平，引物由上海生工生物有限公司合 成 ，IL-2 mRNA 正 义 引 物 ：5′-TACAGCGGAAGCACAGCA-3′，反义引物：5′-CGCAGAGGTCCAAGTTCATC-3′；IL-4 mRNA 正义引物：5′-AACGAGGTCACAGGAGAAGG-3′，反义引物：5′-TTGGAAGCCCTACAGACGAG-3′；IL-5 mRNA 正义引物：5′-CCCTCATCCTCTTCGTTGC-3′，反义引物：5′-ATCCTCCTGCGTCCATCTG-3′；IL-10 mRNA 正义引物：5′-TGCACTACCAAAGCCACAAG-3′，反义引物：5′-TGATCCTCATGCCAGTCAGT-3′；以 β-actin 作为内参照，正义引物：5′-GCATGGCCTTCCGTGTTC-3′，反义引物：5′-GATGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′。RT-PCR反应体系如下:荧光标记染料 2×SYBR Green I Master Mix 5μl，正义引物 0.2μl，反义引物 0.2μl，小鼠脾脏 cDNA 1μl，灭菌三蒸水补至总体积 10μl。条件为：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 15s，72℃ 5min，39 个循环。将以上 PCR 扩增试剂加入96孔反应板中，离心3min，3 000r/min，然后放入Bio-Rad CFX-384荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）反应。反应结束后，应用SDS分析软件（美国应用生物系统公司）进行分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清E2水平比较 3组实验组小鼠血清E2水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；而3组实验组小鼠血清E2水平两两比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

2.2 各组小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比较 3组实验组小鼠血清IgM、IgG水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。手术去卵巢组小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于药物去卵巢组和自然绝经组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

表1 各组小鼠血清E2水平比较

表2 各组小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比较（μg/ml）

2.3 各组小鼠血清CD4/CD8比值比较 自然绝经组CD4/CD8比值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；手术去卵巢组、药物去卵巢组与对照组CD4/CD8比值比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 各组小鼠血清CD4/CD8比值比较

2.4 各组小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表达水平比较 3组实验组小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；各组小鼠IL-10 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。

3 讨论

随着年龄的增长，机体产生抗体减少，固有免疫和非特异性免疫功能均下降，有证据表明，除了年龄因素以外，绝经期卵巢功能下降导致E2缺乏可能与此变化有关[7]，而E2治疗可以阻止或恢复部分免疫缺陷，维持细胞因子和淋巴细胞的动态平衡[8]。有研究提示性激素与妇女免疫功能关系密切，可能通过免疫系统影响肿瘤的发生与发展[9]。然而，E2缺乏和免疫老化的关系仍未明确，有关绝经小鼠细胞因子模式的报道国内较少。笔者前期的实验初步发现去卵巢小鼠进行3个月生理剂量E2补充，未发现对Ig有影响[10]，故本研究进一步通过手术和药物去卵巢小鼠经Con-A刺激后检测E2缺乏状态下年轻与老龄化小鼠之间是否存在此类细胞因子表达的差异，以证实E2是否影响此类细胞因子表达。

表4 各组小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表达水平比较

本研究发现3组实验组小鼠血清E2水平均明显低于对照组，自然绝经组CD4/CD8比值低于对照组，差异均有统计学意义；手术去卵巢组、药物去卵巢组与对照组CD4/CD8比值比较差异均无统计学意义。Kogut等[11]报道CD4/CD8比值倒置是机体免疫缺陷的表现；而Hadrup等[12]报道女性的死亡率增加与CD8+记忆T细胞的数量增多有关，本研究手术去卵巢组、药物去卵巢组与对照组CD4/CD8比值比较差异均无统计学意义，与前期实验结果不一致[13]。

Han等[14]报道老年人的B细胞功能不足还表现在受体多样性的削弱、对抗原反应的下降、对抗体亲和力的降低，进而导致体液免疫下降及外源性自体抗原抗体特异性转变，最终导致自身免疫性疾病如动脉粥样硬化、糖尿病和阿尔茨海默病[15]。本研究3组实验组小鼠血清IgM、IgG水平均明显低于对照组，手术去卵巢组小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于药物去卵巢组和自然绝经组，差异均有统计学意义。笔者认为，在手术去卵巢组中E2的急剧减少将更有可能抑制体液免疫功能，更有效地治疗E2相关的自身免疫性疾病。

IL-2能够促进T细胞、B细胞的分化、成熟和增殖，还能促进Tc细胞的活性并转化为肿瘤浸润淋巴细胞，增强T细胞介导的免疫应答和NK细胞的免疫应答。IL-4能够促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能，IL-5能够促进B细胞分化与生长、诱导嗜酸性粒细胞分化、促进IgA合成和诱导细胞毒T细胞（CTL）的生成。本实验发现3组实验组小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义；各组小鼠IL-10 mRNA表达水平比较差异无统计学意义。提示老龄化小鼠体内IL-2、IL-4、IL-5升高可能由E2缺乏所致，而E2对IL-10水平作用有限。

综上所述，Con-A刺激后E2缺乏状态下年轻与老龄化小鼠之间细胞因子模式是有所不同的，3组实验组IL-2、IL-4、IL-5 mRNA 表达水平升高，IL-10 mRNA 表达水平无明显变化，提示老龄化小鼠体内升高的IL-2、IL-4、IL-5可能由E2缺乏所致，而E2对IL-10水平作用有限。自然绝经组CD4/CD8比值下降，IgM、IgG和IgA抗体水平在手术去卵巢组最低，药物去卵巢组中所有的免疫参数的变化较小。这些结果表明E2缺乏可能只是老年人容易发生免疫缺陷的部分原因，至于老年人免疫功能改变的真正原因一直是讨论和研究的焦点。

[1]Liu L,Zhao Y,Xie K,et al.Estrogen inhibits LPS-induced IL-6 production in macrophages partially via the nongenomic pathway[J].ImmunolInves,2014,43(7):693-704.doi:10.3109/08820139.2014.917095.

[2]Curran EM,Berghaus LJ,Vernetti NJ,et al.Natural killer cells express estrogen receptor-alpha and estrogen receptor-beta and can respond to estrogen via a non-estrogen receptor-alpha-mediated pathway[J].Cell Immunol,2001,214(1):12-20.doi:10.1006/cimm.2002.1886.

[3]Zhao RQ,Zhou MH,Qu W,et al.Inhibitory effect of alarelin microspheres on experimental endometrosis in rats[J].Acta Pharmaceutica Sinica,1999,34(8):565-568.

[4]Martins RR,Pereira NM,Silva TM.Liquid-base cytology:a new method for oestral cycle study in Wistar's rats[J].Acta Cir Bras,2005,20(1):78-81.doi:/S0102-86502005000700009.

[5]Wang JM,Hou X,Adeosun S,et al.A dominant negative ERβ splice variant determines the effectiveness of early or late estrogen therapy after ovariectomy in rats[J].PLoS One,2012,7(3):e33493.doi:10.1371/journal.pone.0033493.

[6]潘文超,周玉娟,段斐,等.复方甘草酸苷对免疫性肝损伤小鼠的保护作用[J].医学研究与教育,2013,30(1):29-32.

[7]Gameiro CM,Roma o F,Castelo-Branco C.Menopause and aging:changes in the immune system--a review[J].Maturitas,2010,67(4):316-320.doi:10.1016/j.maturitas.2010.08.003.

[8]邵明君,何云芹,胡美旭,等雌二醇和孕酮对去卵巢小鼠外周血T细胞反应的影响[J].浙江医学,2012,12(16):1347-1349.

[9]Hinds L,Price J.Menopause,hormone replacement and gynaecologicalcancers[J].Menopause Int,2010,16(2):89-93.

[10]邵明君,何云芹,胡旻,等.雌激素与去卵巢小鼠外周血T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白关系的研究[J].浙江医学,2011,33(12):1793-1795.

[11]Kogut I,Scholz JL,Cancro MP,et al.B cell maintenance and function in aging[J].Seminars Immunology,2012,24(5):342-349.doi:10.1016/j.smim.2012.04.004.

[12]Hadrup SR,StrindhallJ,Kllgaard T,et al.Longitudinalstudies of clonally expanded CD8 T cells reveal a repertoire shrinkage predicting mortality and an increased number of dysfunctional cytomegalovirus-specific T cells in the very elderly[J].J Immunol,2006,176(4):2645-2653.

[13]Shao MJ,Zhu YJ,Qiu YE,et al.Changes in the Level of Immunoglobulins and CD4/CD8 Ratio in Young and Aged Mice with EstradiolDeficiency[J].ImmunologicalInvesttigations,2017,46(3):305-313.doi:10.1080/08820139.2016.1267203.

[14]Han S,Yang K,Ozen Z,et al.Enhanced differentiation of splenic plasma cells but diminished long-lived high-affinity bone marrowplasma cells in aged mice[J].J Immunol,2003,170(3):1267-1273.

[15]Nagele EP,Han M,Acharya NK,et al.NaturalIgG autoantibodies are abundant and ubiquitous in human sera,and their number is influenced by age,gender,and disease[J].PLoS One,2013,8(4):e60726.doi:10.1371/journal.pone.0060726.