对氧磷酶1基因多态性与乳腺癌的相关性研究

傅春燕 程雪 潘颖 陈述政 徐民

乳腺癌是全球第二大常见癌症，也是女性最常见的癌症和死亡原因之一[1-2]。研究显示老龄化、癌症家族史、不良饮食习惯等都是乳腺癌的风险因素[3-5]。内源性代谢物和外源性致癌物质可引起遗传损伤[6]，致癌基因和肿瘤抑制基因突变[7]最终可能导致乳腺癌的发生。此外，在乳腺癌的发生、发展过程中，氧化应激可能对细胞增殖和恶性转化起促进作用[8]。位于染色体7q21.3上的对氧磷酶1（paraoxonase 1，PON1）不仅能够降低氧化应激反应，还与多种癌症的发生、发展有关。Wu等[9]认为PON1多态性可能与乳腺癌的发生风险有关。PON1表达和基因型分布在不同人群中差异很大[10]。PON1基因的编码区存在两种常见的功能性单核苷酸多态性，分别是L55M和Q192R位点基因多态性[10-11]。PON1低活性一直是胃癌[12]、系统性红斑狼疮[13]和心血管疾病[14]等的风险因素。此外，一些研究表明PON1基因L55M和/或Q192R位点基因多态性与上皮性卵巢癌、肺癌等的风险增加相关[15]。本研究探讨PON1基因L55M和Q192R位点基因多态性与患乳腺癌风险之间的相关性，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2010年1月至2015年4月本院乳腺甲状腺外科收治的260例乳腺癌患者作为研究组，另外选同期260例健康妇女作为对照组。经过组织病理学确诊，年龄＞18岁，诊断标准参照《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2013版）》[16]，并使用美国癌症联合委员会（AJCC）分期系统[17]来确定乳腺癌患者的发展阶段，纳入患者治疗前卡氏（KPS）评分＞80分，心电图与心脏功能正常。健康妇女均无任何与PON1基因L55M和Q192R位点基因多态性相关的恶性肿瘤或其他疾病的病史。研究组患者AJCCⅠ期13例，Ⅱ期81例，Ⅲ期126例，Ⅳ期40例；淋巴结N0期 115例，N1期145例；雌激素受体（ER）阳性75例，阴性185例；孕激素受体（PgR）阳性83例，阴性177例。两组年龄、BMI、绝经状态、怀孕史、吸烟和饮酒情况等比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；但研究组患者有乳腺癌家族史的比例显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 两组对象一般资料比较

1.2 方法 收集所有受试者的信息，包括年龄、BMI、绝经状态、乳腺癌家族史、怀孕史、饮酒史、吸烟史，同时收集研究组患者淋巴结转移情况、AJCC阶段、ER和PgR状态。抽取所有受试者约2ml肘静脉血，抽提基因组DNA，通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）对PON1基因L55M和Q192R位点进行基因分型。用于扩增L55M位点目的片段的引物序列如下：正向，5′-GAAGAGTGATGTATAGCCCCAG-3′；反向，5′-TTTAATCCAGAGCTAATGAAAGCC-3′（170bp）。用于扩增Q192R位点目的片段的引物序列如下：正向，5′-TATTGTTGCTGTGGGACCTGAG-3′；反向，5′-CACGCTAAACCCAAATACATCTC-3′（99bp）。PCR 扩增体系为 25μl，分别为 1.0μl的各引物，12.5μl的 Green PCR Master Mix（ThermoFisher，美国，货号 K1081，规格200reactions），9.5μl的无菌去离子水和 2.0μl的模板DNA。PCR仪器为美国伯乐公司T100热循环仪，PCR反应程序为：95℃热变性 5min，95℃ 45s，60℃（L55M）或59℃（Q192R）45s，72℃ 45s，40 个循环，然后在 72℃孵育10min。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上分离，随后用溴化乙锭（Sigma,批号E8751,规格1g）染色观察。进行RFLP分析以检测PCR扩增后的目的片段基因型。将消化的片段在3%琼脂糖上分离，并使用Bio-Rad GelDoc 2000 XR+System（美国伯乐公司）显色。每次运行中设置阴阳性对照，以确保基因型评估的准确性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。使用Pearson双侧 χ2检验评估Hardy-Weinberg平衡，P＞0.05表示符合Hardy-Weinberg平衡。比较两组一般资料的差异时，计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；分类变量组间比较采用χ2检验。研究组和对照组的基因型和等位基因频率的差异采用χ2检验。采用单因素logistic回归分析计算乳腺癌的风险，并计算单纯基因型或等位基因的粗略OR值和95%CI；采用Bonferroni校正年龄、BMI、绝经状态、乳腺癌家族史、怀孕史、饮酒史、吸烟史等参数，采用多因素logistic回归分析计算校正后的OR值和95%CI。采用多因素logistic回归分析确定基因型频率与临床病理参数之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组L55M位点等位基因和基因型频率分布两组受试者的L55M位点的基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。总体分析结果和基于绝经状态的分组分析结果均显示研究组和对照组L55M位点基因型和等位基因频率之间的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。总体分析结果显示，LL基因型频率与LM和MM基因型频率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。在亚组分析中，LL基因型的频率也与LM基因型的频率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。此外，在整体和亚组分析中，LL基因型频率与携带M基因的频率不同，Bonferroni校正后P＜0.05。以LL基因型和L等位基因作为参考，分析乳腺癌的发病风险，结果显示LM基因型、MM基因型、LM+MM基因型或M等位基因与乳腺癌发病风险增加有关（均P＜0.05）。

在基于绝经状态的亚组分析中，绝经前两组受试者中观察到的L55M位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。由于在对照组中未观察到MM基因型，所以无法检查MM基因型与乳腺癌发病风险之间的关联。具有LM基因型和LM+MM基因型或M等位基因与乳腺癌发病风险增加有关（均P＜0.05）。绝经后两组受试者中观察到的L55M位点基因型频率均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。LM 基因型、LM+MM基因型或M等位基因与乳腺癌发病风险增加有关（均P＜0.05），见表 2。

表2 两组L55M位点等位基因和基因型频率分布[例（%）]

2.2 两组Q192R位点等位基因和基因型频率分布两组受试者的Q192R位点基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。总体分析结果显示研究组和对照组Q192R位点基因型和等位基因频率之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。以QQ基因型和Q等位基因作为参考，分析乳腺癌的发病风险，总体分析结果显示，QR基因型、RR基因型、QR+RR基因型或R等位基因与乳腺癌发病风险无关（均P＞0.05）。基于绝经状态的分组分析结果显示研究组和对照组Q192R位点基因型和等位基因频率之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。Q192R基因型或等位基因频率与乳腺癌发病风险均无关（均P＞0.05），见表3。

表3 两组Q192R等位基因和基因型频率分布[例（%）]

2.3 L55M和Q192R位点基因多态性与乳腺癌患者临床病理参数的关系 本研究检测了L55M和Q192R位点基因多态性与乳腺癌患者临床病理参数之间的关系，总体分析结果显示M等位基因与绝经状态和淋巴结转移相关（均P＜0.05）。基于绝经状态的分组分析结果显示在绝经前和绝经后携带M等位基因的乳腺癌患者更容易发生淋巴结转移（均P＜0.05），而Q192R等位基因的突变情况与临床病理参数之间均无关联（均P＞0.05），见表 4～5。

3 讨论

本研究结果显示，乳腺癌患者的LM基因型、MM基因型和M等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义，与相关研究结果一致[17]。此外，笔者采用Bonferroni校正多次测试，使统计学P值更加标准化，通过logistic回归分析可能更适合于探索L55M位点基因多态性与乳腺癌风险之间的关联。研究结果显示，与LL基因型相比，具有LM基因型患者的乳腺癌风险增加了1.543倍，而具有MM基因型患者的乳腺癌风险增加了1.906倍。另外，LM＋MM基因型或M等位基因携带者患乳腺癌风险分别增加了1.579倍和1.545倍。此外，MM基因型患者的乳腺癌风险高于至少1个M等位基因携带者（LM基因型、LM＋MM基因型和M等位基因）的风险，与国外研究结果一致[18]，然而，国外研究结果显示，乳腺癌患者和正常人中携带M基因的频率明显高于本研究中的统计结果，可能是由于人种的差异所致。据单倍型图（HapMap）数据库的数据显示，我国西部地区的种族人群比东部人群更容易出现M等位基因突变。本研究中对照组只有8.5%为M等位基因突变携带者，与HapMap数据库中北京汉族人群的数据一致。另外，针对美国和埃及患者的研究结果显示，L55M位点M等位基因突变携带者患乳腺癌的风险明显更高[19]。

在基于绝经期的亚组分析中，绝经前对照组中未观察到MM基因型。因此，需要较大的对照组样本量来检查这种基因型患者绝经状态和乳腺癌风险之间的关系。Lucio等[20]研究发现，与对照个体相比，具有MM基因型的绝经前妇女的乳腺癌风险增加了3.83倍；然而，他们的研究未发现LM基因型患者患乳腺癌的风险增加。本研究中MM基因型与乳腺癌发病风险之间的相关性相对较弱，需要进一步扩大样本量进行研究。

在研究组或对照组中，笔者均未发现Q192R位点等位基因和基因型频率与乳腺癌发病风险的相关性，与Hussein等[19]研究一致。然而，Gallicchio等[21]发现 Q192R位点基因多态性与侵入性乳腺癌的发病风险降低有关，Lucio等[20]报道Q192R位点R等位基因与乳腺癌的发病风险降低有关。亚组分析研究发现仅在绝经后组才观察到Q192R位点R等位基因与乳腺癌降低风险之间的关系[20]，这说明R等位基因不会降低绝经前妇女的乳腺癌风险。本研究中笔者并未发现在绝经前或绝经后组中Q192R位点基因多态性与乳腺癌风险之间的关系。本研究结果与Gallicchio等[21]的差异说明Q192R位点基因多态性与乳腺癌风险之间关系可能与人种差异有关。近年来，Meta分析探讨了PON1基因Q192R位点基因多态性与乳腺癌发病风险的相关性，研究结果均认为Q192R位点基因多态性与乳腺癌风险并无显著相关性[22-23]，但Fang等[22]发现R等位基因一般在亚洲人群中与癌症风险降低相关。结合前面的研究和本次研究结果可以看出，R等位基因与中国人群对乳腺癌的易感性增加并无相关性。不过关于其他地区和民族群体的流行病学研究需要进一步研究。

表4 L55M位点基因多态性与乳腺癌患者临床病理参数的关系

本研究在检测L55M和Q192R位点基因多态性与乳腺癌患者临床病理参数之间的关系时，总体分析结果显示M等位基因与绝经状态和淋巴结转移相关。基于绝经状态的亚组分析结果显示在绝经前和绝经后携带M等位基因的乳腺癌患者更容易发生淋巴结转移。在以前的两项研究中也观察到M等位基因与淋巴结转移之间的关联[17,24]。此外，Ahmed等[17]指出M等位基因与缺乏ER有关。本研究结果中也观察到类似的趋势，但是这种差异无统计学意义。相比之下，M等位基因与此处观察到的绝经后状态之间相关性的报道较少。Xu等[25]表明绝经状态是中国人群发生乳腺癌的危险因素，M等位基因突变可能在促进肿瘤发展中发挥重要作用。相比之下，本研究未发现Q192R位点等位基因的突变情况与临床病理参数之间的相关性。

表5 Q192R位点基因多态性与乳腺癌患者临床病理参数的关系

综上所述，本研究探讨了PON1基因L55M和Q192R位点基因多态性与患乳腺癌风险之间的相关性。研究发现L55M位点M突变与患者的乳腺癌风险增加有关，并且可能在肿瘤发展中发挥重要作用。相比之下，Q192R位点R等位基因可能不是该群体中乳腺癌敏感性和预后的合适标记。然而，由于本研究样本相对较小，不能够分析我国不同民族女性差异的情况，其临床意义可能有所限制。需要未来具有较大样本量和不同种族妇女的研究，以研究PON1基因多态性作为乳腺癌风险和肿瘤预后的遗传标记的作用。

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