食品中角鲨烯样品前处理与检测方法研究进展

刘纯友，靳国锋，马美湖*，耿 放，金永国，邱 宁

(1.华中农业大学 食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；3.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106)

角鲨烯又名鲨烯，化学名为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，是6个异戊二烯连接而成的开环三萜类化合物，其化学结构如图1所示[1]。角鲨烯是存在于动植物、微生物和海洋微藻等脂肪组织中的一种功能性活性脂质，具有抗氧化[2]、调控胆固醇代谢[3-4]、防癌抗癌[3,5]、携氧[5]、抗辐射[6]、解毒[7]、皮肤保湿和抑制微生物生长[8]等多种生物活性功能，被广泛应用于功能食品、医药产品和化妆品的开发。因此关于不同食品材料中角鲨烯含量的分析一直是国内外相关学者研究的重点与热点。截止目前，国家卫生部门尚未颁布食品中角鲨烯的卫生标准，国内外也未见关于不同食品中角鲨烯样品前处理与检测方法的综述报道。

图1 角鲨烯的化学结构[1]Fig.1 Chemical structure of squalene[1]

食品中角鲨烯的分析方法主要包括样品前处理方法与检测方法。样品前处理是分析的关键步骤之一，直接影响到测定结果的准确性和分析效率。根据样品基质的差异，样品的前处理方法主要分为传统提取方法和新型提取方法两大类。传统提取方法包括有机溶剂提取法、皂化法和分步结晶法，新型提取方法有固相萃取法、固相微萃取法和超临界CO2萃取法。关于角鲨烯的检测技术最先是采用红外光谱法(IR) 检测深海鲨鱼肝油中角鲨烯[9]，随后有学者应用气相色谱法(GC)检测橄榄油及其脱臭馏出物中角鲨烯含量[10]，以及采用高效液相色谱(HPLC)法和超高效液相色谱法(UPLC)检测植物油、保健食品和有机特级粗榨橄榄油中角鲨烯含量[11-15]。最近，国内外学者相继使用气相色谱-质谱联用(GC-MS)法测定植物油脱臭馏出物、南瓜籽油和茶籽油中角鲨烯的含量[16-19]。本文对食品中角鲨烯样品前处理与检测方法的研究概况和最新研究成果进行系统梳理与归纳，并对今后食品中角鲨烯样品前处理与检测方法的发展方向进行了展望，旨在为不同食品中角鲨烯的分析提供参考与借鉴。

1 食品中角鲨烯的样品前处理方法

1.1 有机溶剂提取法

有机溶剂提取法是提取动植物原料中角鲨烯的传统方法之一。由于角鲨烯是一种亲脂性的小分子物质，一般采用乙醚、石油醚和正己烷等有机溶剂进行提取[20]。李冬梅等[21]研究了不同提取溶剂对茶油中活性角鲨烯含量的影响，结果显示正己烷作为溶剂提取得到的角鲨烯含量最高(7.62%)，而丙酮提取得到的角鲨烯含量较低(0.29%)。唐小红等[22]研究了不同萃取溶剂对深海鱼油中角鲨烯含量测定的影响，结果表明混合溶剂(正己烷∶氯仿=4∶1，体积比)萃取角鲨烯的效果最好(145.18 mg/g)，优于正己烷、乙醚和石油醚的萃取效果。可见，不同有机溶剂对角鲨烯的提取有较大影响，这可能与样品基质特性复杂多样关系密切。

1.2 皂化法

由于角鲨烯是一种不皂化物，皂化法是目前国内外提取动植物油脂中角鲨烯的主要前处理方法之一。试样通常先用氯仿-甲醇法或索氏提取法提取油脂，再加入氢氧化钾溶液对油脂进行皂化反应，去除甘油三酯和磷脂等可皂化物，再用正己烷或二氯甲烷提取不皂化物[23-24]。角鲨烯在提取过程中易发生乳化现象，降低回收率，加入氯化钠溶液可以抑制样品前处理过程中乳化现象的发生，提高角鲨烯的回收率。

1.3 分步结晶法

采用分步结晶法时，试样先用甲醇-丙酮溶液溶解，然后冷冻保存，溶液过滤后减压浓缩回收溶剂，残留物再用丙酮溶解进样分析[25-26]。Nenadis等[27]采用分步结晶的方法，先用甲醇-丙酮溶液溶解橄榄油样，然后置于(-22±1) ℃保存24 h以去除饱和甘油三酯，上层溶液过滤，经减压浓缩富集后进样分析。由于分步结晶法存在耗时长、操作繁琐等缺点，目前其作为角鲨烯的前处理方法应用较少。

1.4 固相萃取法

固相萃取法(Solid phase extraction,SPE)采用选择性吸附、选择性脱附的方式对样品中的角鲨烯进行提取、分离、富集和净化，是近年来植物油中角鲨烯含量测定的新兴前处理方法。SPE法是目前国内外提取橄榄油中角鲨烯的常用方法之一，通常先用正己烷或甲醇将固相萃取柱(Strata SI-1柱和Bond Elute LRC氨丙基柱)活化，将样品溶液溶解后加入固相萃取柱，再用少量弱极性有机溶剂将角鲨烯洗脱下来，经减压浓缩后进样分析[28]。Sagratini等[29]先用正己烷对硅胶固相萃取柱进行活化处理，上样后用正己烷-乙酸乙酯(9∶1,体积比)洗脱，洗脱液经氮气富集后用异丙醇-四氢呋喃(7∶3，体积比)溶解，采用高效液相色谱法实现了对样品中角鲨烯、生育酚和β-胡萝卜素的同时测定。与有机溶剂提取法、皂化法相比，SPE消耗有机溶剂量大大降低，样品回收率高，克服了两者干扰多、回收率低的缺点，但SPE需要专门的固相萃取柱和固相萃取装置，分析成本较高。

1.5 固相微萃取法

固相微萃取法(Solid phase microextraction,SPME)是在固相萃取基础上发展起来的一项样品前处理新技术，主要基于石英纤维表面涂渍的不同极性固定相对样品基质中的目标化合物进行萃取和富集，再在色谱仪的进样口进行解吸，大大缩短了样品的前处理时间，提高了分析速度和方法灵敏度。赵明桥等[30]选取100 μm非极性固定相聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)作为SPME萃取头，研究了海水中角鲨烯的萃取时间、搅拌速度、介质离子强度、解吸温度和解吸时间对角鲨烯浓度测定的影响，通过监测海水中角鲨烯浓度的变化来预报海洋赤潮的发生。SPME方法简单、萃取速度快、富集效率高，并可与GC-MS仪进行联机使用，可实现食品中角鲨烯的快速定性与定量分析。笔者采用SPME/GC-MS技术对冻干牦牛肉样品中角鲨烯进行快速测定，研究发现冻干牦牛肉中存在角鲨烯，其含量达315.43 μg/g[5]。

1.6 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法是目前萃取植物源角鲨烯的天然绿色新方法之一。Kraujalis等[31]选择超临界CO2萃取压力为55 MPa，添加5%的乙醇作为助溶剂对苋菜籽中角鲨烯和生育酚进行萃取，不皂化物中角鲨烯和生育酚含量分别为0.289 g/100 g和317.3 mg/kg。Xu等[32]采用超临界CO2对荷花花粉中荷花油、β-胡萝卜素、甾醇和角鲨烯进行萃取，并用两因素中心旋转组合试验设计对萃取条件进行优化。结果表明，在萃取压力38.2 MPa和温度49.7 ℃条件下萃取2.5 h，荷花花粉的产油量、β-胡萝卜素、甾醇和角鲨烯的产量分别为47.18 g/kg、377.86 mg/kg、84.94 mg/kg 和 490.90 mg/kg，且萃取压力和温度对β-胡萝卜素、植物甾醇和角鲨烯的产量有显著影响。与其他方法相比，超临界CO2萃取法具有萃取条件温和、选择性好、提取效率高、无有毒有害溶剂残留、能较好地保持角鲨烯生物活性的优点，但也存在设备成本高，萃取釜不能连续萃取的缺点。通过对不同食品中角鲨烯样品前处理方法进行比较分析，其优缺点归纳于表1。

表1 食品中角鲨烯样品前处理方法比较分析Table 1 Comparative analysis of squalene samples pretreatment methods in food

(续表1)

2 角鲨烯检测方法

目前，国内外文献报道的食品中角鲨烯含量的检测方法主要包括气相色谱法、液相色谱法和气相色谱-质谱联用法，其中以气相色谱-质谱联用和液相色谱法应用较多。

2.1 气相色谱法

气相色谱法是目前测定食品中角鲨烯含量的重要分析方法之一。采用GC测定食品中角鲨烯的含量，试样通常需先进行皂化或甲酯化前处理，提取样品中不皂化物后进样分析[33]。GC检测食品中角鲨烯时，毛细管柱类型、柱温优化、载气流速和检测器均是主要影响因素。

2.1.1色谱柱的选择色谱柱的选择是影响分离样品中角鲨烯的重要因素之一，包括色谱柱的固定相和规格(柱长、内径和膜厚)的选择。目前国内外文献报道分析角鲨烯的色谱柱主要有极性和非极性毛细管色谱柱，其中以非极性毛细管色谱柱为主，固定相主要有100%甲基聚硅氧烷和5%苯基-甲基聚硅氧烷等[34-36]。因角鲨烯是一种强非极性化合物，故选取非极性固定相较为合适；由于角鲨烯在正常大气压的沸点为285 ℃，为保证角鲨烯在汽化室中充分汽化，因此固定相需耐高温且低流失。

2.1.2柱温的选择柱温是影响角鲨烯分离效果的主要因素之一，主要有恒温和程序升温两种方式。当样品基质中组分较为简单时可采用恒温方式。对于基质较为复杂且沸点范围较宽的样品，可采用程序升温方式，以实现角鲨烯与样品中其他组分完全分离。柱温的高低直接影响角鲨烯的分离效果和分离时间。降低柱温在一定程度上可以改善样品中角鲨烯与其他组分的分离度，但会增加分析时间。提高柱温可以增加角鲨烯的传质速度，缩短分析时间，但柱温不宜超过色谱柱的最高耐受温度，否则固定液易发生降解和流失，导致分离效率大大降低。

2.1.3检测器的选择GC常用的检测器有氢火焰离子化检测器(Flame ionization detector,FID)、电子捕获检测器(Electron capture detector，ECD)、火焰光度检测器(Flame photometric detector,FPD)和氮磷检测器(Nitrogen phosphorus detector,NPD)。不同类型检测器对不同化合物的选择性和灵敏度不同，且具有不同的适用范围。ECD检测器对含卤素等电负性强的化合物有较高的灵敏度；FPD检测器主要对含硫、磷的化合物有响应信号；NPD检测器对含氮、磷、硫和卤素等元素的化合物较灵敏;FID检测器对碳氢化合物的检测有较高灵敏度。由于角鲨烯是由碳和氢元素组成的碳氢化合物，故FID是目前文献报道测定角鲨烯使用最为普遍的检测器[24,36-41]。

2.1.4载气及其流速的优化载气及其流速是影响角鲨烯分离的重要因素之一。载气的选择与检测器对载气的要求有关。文献报道GC检测角鲨烯应用较多的检测器为FID。邹海民等[36]研究了不同载气流速1.0、1.5、2.0 mL/min对功能食品中角鲨烯分离的影响，结果显示载气流速为2.0 mL/min时，角鲨烯的峰形较好。合适的载气流速可以改善角鲨烯的峰形，减少色谱峰拖尾，提高分析效率。关于食品中角鲨烯的气相色谱检测方法应用如表2所示。

表2 食品中角鲨烯的气相色谱检测方法Table 2 Gas chromatography detection methods of squalene in food

(续表2)

2.2 液相色谱法

液相色谱法(LC)是国内外分析食品中角鲨烯含量的主要检测方法之一，包括高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(UPLC)。与HPLC相比,UPLC使用更小颗粒直径填料(≤2.0 μm)、死体积和更高工作压力(8 000～15 000 psi)及线性速度，较HPLC在灵敏度、分离度和分析速度方面分别提高了2倍、2倍和9倍[45]。由此可见，UPLC是未来检测食品中角鲨烯的重要发展方向。分离模式选择、流动相体系选择和检测器选择是影响LC检测食品中角鲨烯的主要因素。

2.2.1分离模式的选择分离模式是影响食品中角鲨烯分离效果的主要因素之一。基于固定相与流动相之间的极性差异，LC检测食品中角鲨烯的分离模式主要包括正相色谱与反相色谱两种[29-31]，其中以反相分离模式应用较多。反相分离模式使用的反相色谱柱主要包括C30[31]和C18[45-46]柱，其中以C18柱占绝大多数。反相C18柱的固定相是以硅胶为基质，表面键合极性相对较弱的十八碳正构烷烃。正相色谱柱的固定相以硅胶为基质，表面键合极性官能团，如氨基(NH2)和氰基团(CN)。正相色谱柱适合分离光学异构体和反相色谱柱不能分离的极性较大的化合物。由于角鲨烯是弱极性化合物，故反相C18比较适合食品中角鲨烯的分析测定，而目前正相色谱柱使用则相对较少。

2.2.2流动相体系的选择流动相体系直接影响到样品中角鲨烯的分析效率。根据样品中目标化合物的极性差异，文献报道测定食品中角鲨烯使用的流动相体系主要有一元、二元和多元溶剂体系。当分析的样品组分较为简单时，采用一元溶剂体系较多，主要包括乙腈和甲醇等[11,46]，而样品组分较为复杂时应用二元或三元溶剂体系进行梯度洗脱居多。二元溶剂体系主要有乙腈-水[14]、丙酮-乙腈[47]、正己烷-异丙醇[48]、甲醇-水[49]、乙腈-异丙醇[50]和甲醇-乙腈[51]。三元溶剂体系主要有乙腈-异丙醇-正己烷[12]、乙腈-甲醇-异丙醇[29]、乙腈-甲醇-二氯甲烷[31]和甲醇-异丙醇-醋酸[52]等。在洗脱模式方面，LC检测食品中角鲨烯可分为等度洗脱和梯度洗脱两种。当样品组分较为简单时，采用等度洗脱模式；若样品组分较为复杂时，则采用梯度洗脱模式。

2.2.3检测器的选择目前国内外报道LC检测角鲨烯的检测器有紫外-可见(UV-Vis)检测器、二极管阵列检测器(PDA)和蒸发光散射检测器(ELSD)等，其中以UV-Vis和PDA检测器占绝大多数，这可能与角鲨烯在紫外光区有较强的吸收峰有密切联系。笔者采用PDA检测器在190～400 nm波长范围对角鲨烯进行光谱扫描，发现角鲨烯在195 nm波长处有最大紫外吸收峰，实验结果与Lu等[25]的报道相一致。关于食品中角鲨烯的液相色谱检测方法应用如表3所示。

表3 食品中角鲨烯的液相色谱检测方法Table 3 Liquid chromatography detection methods of squalene in food

2.3 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用(GC-MS)是目前分析食品中角鲨烯的主流检测技术之一，可对样品中角鲨烯进行准确定性定量分析。与GC、HPLC相比，GC-MS具有较高的灵敏度和选择性，可以满足复杂样品基质中角鲨烯的痕量分析需要。GC-MS联用法包括气相色谱和质谱两部分，其中气相色谱是角鲨烯的“分离器”，质谱则是角鲨烯的“检测器”。

2.3.1角鲨烯的离子化方式GC-MS分析中最常用的离子化方式有电子轰击离子化(EI)和化学离子化(CI)两种，其中EI是目前文献报道GC-MS测定食品中角鲨烯最常用的离子化方式。笔者应用GC-EI-MS联用定性分析牦牛肉中角鲨烯时发现，角鲨烯的分子离子峰[M+]为m/z410，[M+]受到EI源中高能电子束的轰击，进一步碎裂产生m/z69、81、95、137、231等多个特征碎片离子，实验结果与赵明桥等[30]的报道相一致。

2.3.2角鲨烯的扫描模式质谱质量分析器主要采用全扫描(Scan)和选择离子扫描(SIM)两种扫描模式。Scan扫描主要用于组分的定性分析，而SIM扫描常用于微量或痕量组分的定量分析。汪运明等[18]采用GC-MS联用法对茶油中角鲨烯进行SIM扫描，以三十二烷为内标，检测离子角鲨烯为m/z69、81、95，正三十二烷为m/z57、71、85，实现了对兴宁和赣州茶油中角鲨烯的准确定量分析，含量分别为12.43、97.05 μg/mL。毛多斌等[56]应用GC-MS联用法在质荷比m/z35～500范围内对葵花籽油、南瓜籽油、山楂籽油和省沽油籽油进行Scan扫描，实现了对4种功能性植物油中角鲨烯和维生素E的准确定性。由于SIM扫描模式在设定时间对单个离子扫描的次数明显高于Scan模式，因此SIM扫描模式测定的灵敏度高于Scan模式。

2.3.3角鲨烯的定性分析GC-MS可以通过质谱谱库检索和解析对样品中角鲨烯进行定性，常用的质谱谱库有NIST库和EPA/NIH/Wiley库。相同试验条件下，样品中是否含有角鲨烯的定性过程可从以下两方面考虑：一是样品中角鲨烯选定的特征碎片离子的保留时间与角鲨烯标准品对应的特征碎片离子的保留时间相符合；二是样品中角鲨烯选定的特征碎片离子的丰度比与角鲨烯标准品对应的特征碎片离子的丰度比相符合。

2.3.4角鲨烯的定量分析目前文献报道角鲨烯的定量方法主要有外标法和内标法两种。外标法是使用较为广泛的定量方法之一。当选用外标法定量时，样品前处理过程中的实验环境条件、人为操作因素以及仪器本身的工作稳定性等易给检测结果带来较大的误差；当采用内标法定量，以角鲨烯与内标物的比值定量，样品前处理过程中的角鲨烯和内标物影响相同，可以减少上述因素带来的误差，提高对角鲨烯检测的准确性。关于食品中角鲨烯的气相色谱-质谱联用检测方法应用归纳于表4。

表4 食品中角鲨烯的气相色谱-质谱联用检测方法Table 4 Gas chromatography-mass spectrometry detection methods of squalene in food

(续表4)

3 结论与展望

除深海鲨鱼肝脏外，角鲨烯在样品中含量低，样品基质复杂，干扰物质较多，且角鲨烯本身化学性质较为活泼，在光照和高温条件下容易发生氧化降解，增加了分析检测的难度。因此，在实际检测工作中需根据样品的基质特性，不同样品前处理方法的应用范围及分析仪器的特点选择合适的样品前处理方法。鉴于角鲨烯是一种不皂化物，因此皂化法是国内外萃取不同食品中角鲨烯的经典前处理方法，但该法步骤繁琐、耗时长、消耗大量有机溶剂。超临界CO2萃取法、固相萃取和固相微萃取不需或仅需少量有机溶剂，特别是超临界CO2萃取法的萃取条件较为温和，萃取效率高，特别适合热敏性高、易发生氧化功能活性物质的萃取，可能是今后萃取不同食品材料中角鲨烯的重要发展方向。不同食品中角鲨烯的检测方法有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱法，其中气相色谱-质谱联用技术的高灵敏度、高选择性以及可提供分子结构信息等优势使其逐渐成为角鲨烯的主流检测方法，可实现对复杂生物质样品中角鲨烯含量的快速准确测定。因此，发展高效、高通量、高选择性的样品前处理与高灵敏度的检测技术成为未来发展的重要方向，并将具有更为广阔的应用前景。

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