香豆素类比率荧光探针的合成及其对亚硫酸盐与硫化氢的区分检测

姚余华,田海玉,裴晓良,陈 扬,张维冰,钱俊红

(上海市功能性材料重点实验室,华东理工大学 化学与分子工程学院,上海 200237)

含硫化合物如亚硫酸盐、硫化氢和硫醇是常用的化学试剂[1-3],在环境和生物领域亦发挥着不同的作用[4-5]。亚硫酸盐能有效防止食物氧化变质，是一种常见的食品添加剂、药物保鲜剂和防腐剂[6-8]。在生物体内，亚硫酸盐参与很多重要的生理过程，例如调节心血管功能和提高细胞的抗氧化能力[9-11]。然而，过量摄入亚硫酸盐会对人体造成伤害，严重时可能引发某些疾病。因此，许多国家制定了相应标准控制食品、药品中亚硫酸盐的含量。H2S是继NO和CO之后的第3种气体信号分子[12-13]，具有重要的生物活性，可参与有机体的多种生理、病理过程，如调节神经传递、抑制胰岛素分泌等[14]，其浓度异常可能与哮喘、胃肠痛等多种疾病有关。因此，建立快速、灵敏、高选择性地检测上述含硫物质的分析方法对食品安全、疾病诊断等具有重要意义[15]。荧光检测法因灵敏度高、选择性好和响应速度快等优点在分析化学领域备受关注。基于含硫化合物与金属离子的络合作用[16]、亲核活性[17]、还原作用[18]以及与醛基反应[19]等特性，科学工作者设计合成了很多荧光探针用于此类物质的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

紫外可见分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific,Evolution 220),荧光光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific,Lumina),核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司,AV-400)，质谱仪(美国,MA 1212),超纯水仪(德国Sartorius)；所用药品均购自上海凌峰化学试剂有限公司或阿拉丁试剂上海有限公司，所用试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 探针合成

1.2.1化合物m1的合成根据文献的方法合成得到中间体m1[20]。

1.2.2化合物m2的合成在100 mL圆底烧瓶中加入苯乙酮(0.024 mol,2.8 mL)、丙二腈(0.024 mol,1.59 g)、醋酸铵(0.2 mol,0.37 g)、冰醋酸(1.1 mol，1.5 mL)和甲苯(20 mL)，将反应液加热回流1 h后冷却至室温，再用150 mL饱和碳酸氢钠溶液和50 mL水依次洗涤后，旋蒸除去溶剂，所得固体用无水乙醇重结晶，得到白色固体m2(2.41 g,60%)。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):2.65(s,3 H),7.54(m,5 H)。

图1 探针MSP的合成路线Fig.1 The synthesis procedures of probe MSP

1.2.3探针MSP的合成将1 mL吡咯烷滴加至溶有1.0 gm1(3.72 mmol) 和1.8倍当量m2的50 mL CH2Cl2/EtOH(体积比为1∶1)溶液中。将混合液在室温下搅拌10 h后减压去除溶剂，所得固体用硅胶柱(DCM/EA=2∶1)分离后得到深黑色晶体即为探针MSP(0.75 g，48%),其合成路线见图1。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):1.97(m,4 H),2.76(t,2 H,J=6.10 Hz),2.86(t,2 H,J=6.35 Hz),3.35(q,4 H),6.91(m,2 H),7.34(d,1 H),7.36(d,1 H),7.44(m,1 H),7.52(m,3 H),7.70(s,1 H),7.88(d,1 H)。HR-MSm/z:420.170 7(M+H)+,C23H21N2O3+理论计算值:420.163 4(M+H)+。

1.3 溶液配制

准确称取MSP溶于DMF中，配制3 mmol/L MSP储备液；准确称取Na2SO3和Na2S分别溶于一定体积的PBS(20 mmol/L,pH 7.4)缓冲溶液中，配制成30 mmol/L的Na2SO3或Na2S储备液；按上述方法配制30 mmol/L的其他分析物储备液。

1.4 滴定实验

准确量取10 μL探针储备液于3 mL PBS中配成10 μmol/L的探针溶液，再加入不同体积的Na2SO3或Na2S储备液，得到一系列不同浓度的待测样品溶液。放置10 min(Na2SO3)或3 h(Na2S)后测试体系的吸收和发射光谱。

1.5 细胞实验

移取200 μL L929细胞液于2 mL细胞培养皿中，将其置于37 ℃含5% CO2的培养箱中，用2 mL含10%胎牛血清的Dulbecco’s改良培养基(DEME)培养24 h。此后，用无菌PBS(20 mmol/L，pH 7.4)冲洗细胞3次，再用含有10 μmol/L探针MSP的无血清DEME培养基培养30 min。Na2SO3或Na2S测试实验中，在细胞用无菌PBS冲洗3次前，先用含0.5 mmol/L Na2SO3/Na2S的无血清DEME培养基培养30 min/3 h，后续操作与前述一致。最后，几个试样均用无菌PBS冲洗3次后进行荧光成像。在488 nm激发波长下，同时采集绿色通道(500～550 nm)和红色通道(662～737 nm)的荧光信号。

2 结果与讨论

2.1 探针对亚硫酸盐及硫化氢的光谱响应

由图2可知，探针MSP的最大吸收和发射波长分别位于572 nm和690 nm(图2A～B)，较长的发射波长使其在实际样品检测中具有潜在应用。为研究探针对含硫化合物的光谱响应，首先测试了PBS-DMF缓冲溶液中(20 mmol/L,pH 7.4,体积比1∶2)亚硫酸盐与探针混合体系的吸收光谱随时间的变化曲线。由图2A可知，亚硫酸盐的加入使得探针MSP在572 nm处的吸收峰强度迅速降低，同时在464 nm处产生一个新的吸收峰，后者的吸光度在2 min内达到最大值，且在484 nm处出现一个等吸收点，表明该体系中生成了新的化合物，此时溶液颜色由橙红色变成淡黄色。同时，探针MSP在 690 nm处的发射峰迅速降低并在510 nm处出现了一个新的发射峰(图2B)；在荧光灯照射下，溶液的颜色由红色变为蓝绿色。随后，又研究了探针MSP对硫化氢的光谱响应(图2C～D)，与亚硫酸盐类似，硫化氢的加入亦使得探针的吸收和发射波长明显蓝移，但MSP-H2S体系的光谱变化较为缓慢。从图2E可以更直观地看出，当反应时间延长至3 h时，MSP-H2S体系的光谱变化才趋于平衡，在反应时间为10 min时，该体系的光谱变化较小，而MSP-Na2SO3体系已达到平衡。值得注意的是，当探针MSP与硫化氢的反应时间达3 h时，探针在510 nm处的荧光强度急剧增大，其与690 nm处的荧光强度相比(I510/I690)增加了260倍(图2F)，远高于亚硫酸盐对探针荧光光谱的影响。上述结果表明，该探针对亚硫酸盐和硫化氢的响应速度不同，且两种含硫化合物对探针的荧光光谱影响也有明显差异。因此，可利用反应动力学和荧光强度的变化实现对亚硫酸盐和硫化氢的区分检测。

2.2 探针对亚硫酸盐及硫化氢的选择性与竞争性

测试了其他潜在干扰物(多种阴离子与生物硫醇)与亚硫酸盐/硫化氢共存时对探针MSP的光谱影响。结果显示，上述干扰物几乎不干扰探针对亚硫酸盐和硫化氢的检测，表明探针MSP具有良好的选择性和竞争性，可用于对实际样品中亚硫酸盐和硫化氢的检测。

2.3 亚硫酸盐与硫化氢浓度对探针光谱性质的影响

线性范围和检出限是探针定量检测的重要指标。分别选择反应时间为10 min和3 h研究了亚硫酸盐(图5A)和硫化氢(图5B)浓度对探针MSP吸收/发射光谱的影响。由图5A可知，随着亚硫酸盐浓度的增大，探针在572 nm处的吸光度值逐渐降低，464 nm处产生一新的吸收峰且其强度随亚硫酸盐浓度的增加而逐渐增大，当亚硫酸盐浓度达到400 μmol/L时，探针溶液的吸收光谱几乎不变。以探针在464 nm和572 nm处的吸收强度比(A464/A572)对亚硫酸盐浓度作图可知，在0～200 μmol/L浓度范围内，A464/A572与亚硫酸盐浓度呈良好的线性关系(r2=0.984 3)，其对亚硫酸盐的检出限(3σ/k)为0.95 μmol/L。当反应时间为3 h时，在0～500 μmol/L浓度范围内，I510/I690与硫化氢浓度呈线性关系(r2=0.993 7)，对硫化氢的检出限(3σ/k)为0.6 μmol/L。以上结果表明探针MSP在亚硫酸盐和硫化氢高选择性、高灵敏度定量方面有潜在应用价值。

2.4 探针对亚硫酸盐及硫化氢的细胞成像

将探针MSP用于对L929细胞中亚硫酸盐和硫化氢的荧光成像，结果如图6所示。当细胞仅用探针MSP培养后，在红色通道显示较强的荧光，而绿色通道几乎没有荧光(图6A～D)。当L929细胞先用Na2SO3培养30 min后再用探针MSP培养30 min，可观察到细胞内绿色荧光略有增强，同时红色荧光明显降低(图6E～H)；当L929细胞先用Na2S培养3 h再用探针培养30 min后，细胞内观察到很强的绿色荧光，而红色荧光显著降低(图6I～L)。上述结果表明，探针MSP在区分检测活细胞内亚硫酸盐和硫化氢方面有潜在应用价值。

图6 L929细胞的荧光成像图Fig.6 Fluorescence imaging of L929 cellsA-D:L929 cells incubated with MSP for 30 min(用探针MSP培养30 min);E-H:L929 cells were pretreated with Na2SO3 for 30 min then incubated with MSP for further 30 min(L929细胞先用Na2SO3培养30 min再用探针MSP培养30 min);I-L:L929 cells were pretreated with Na2S for 3 h then incubated with MSP for another 30 min(L929细胞先用Na2S培养3 h再用探针MSP培养30 min)；A,E,I:green channel obtained from 500-550 nm;B,F,J:red channel obtained from 662-737 nm;C,G,K:bright field;D,H,L:merged imaging;[MSP]=10 μmol/L,[Na2SO3]=0.5 mmol/L,[H2S]=0.5 mmol/L,excited at the 488 nm

3 结 论

本文基于亚硫酸盐与硫化氢亲核活性的差异，设计合成了一个香豆素类比率荧光探针MSP用于对两者进行区分检测。通过将强吸电子基团二氰基亚甲基苯共轭连接到香豆素荧光团上，使得探针具有较长的吸收和发射波长(λab=572 nm，λem=690 nm)以及较高的反应活性。该探针可实现对亚硫酸盐的快速、比色响应以及对硫化氢的比率荧光响应,并可用于活细胞内亚硫酸盐和硫化氢的荧光成像。

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