格尔德霉素和环孢素联合常用抗真菌药对阿萨希毛孢子菌临床株体外药敏研究

廖 勇，杨苏腾，丛 林，彭卓颖，郎德休，敖俊红，杨蓉娅

毛孢子菌既可正常定植于人体的皮肤、黏膜，同时也可以引起季节性过敏性肺炎、浅部和深部感染[1]，毛孢子菌引起深部感染的病死率可高达77%[2]。侵袭性毛孢子菌病是一种少见、但致死性强的真菌感染性疾病，主要累及免疫功能缺陷的宿主。侵袭性毛孢子菌病最常见的感染类型是毛孢子菌菌血症，其中阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii）为最常见的病原菌[2]。研究发现，1975年—2014年毛孢子菌菌血症全球的报道数量逐渐增加，但患者的病死率未见明显改善[2]；而且，毛孢子菌属具有特定的耐药模式，其对棘白菌素类抗真菌药先天耐药，对于两性霉素B敏感性不高[1]。最新的指南和一些回顾性研究推荐系统使用三唑类抗真菌药治疗侵袭性毛孢子菌病[3]，特别是伏立康唑具有良好的体外和体内抗毛孢子菌活性。三唑类抗真菌药属于抑菌药，长期临床应用可能出现临床耐药的风险。体外实验证明，长时间暴露于氟康唑可获得高最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值的阿萨希毛孢子菌耐药株[4]。近年来已经有阿萨希毛孢子菌的氟康唑高MIC值临床株的报道[5]，甚至有阿萨希毛孢子菌多药耐药株的临床报道[6]。因此，需要探索针对侵袭性毛孢子菌病新的抗真菌治疗策略。

热休克蛋白90（heat shock protein，Hsp90）是真核细胞的信号通路和应激反应中重要的调控分子，研究发现其在病原真菌对三唑类抗真菌药耐药中发挥重要作用，且主要是通过钙调磷酸酶通路[7]。既往的研究已经发现Hsp90抑制剂和环孢素单独使用或联合常用抗真菌药对念珠菌和酿酒酵母均具有体外抑制作用[8,9]。Cowen和Lindquist[9]研究显示抑制酿酒酵母Hsp90的功能可以阻断其对唑类抗真菌药快速诱导耐药的发生。 Kubica 等[10]最新的研究发现他克莫司（钙调磷酸酶抑制剂）可增强两性霉素B和卡泊芬净对阿萨希毛孢子菌的体外抗真菌活性。Hsp90抑制剂和其他钙调磷酸酶抑制剂（环孢素）对阿萨希毛孢子菌的体外活性仍不清楚。本研究检测了Hsp90抑制剂（格尔德霉素）和环孢素单独和联合5种常用抗真菌药（氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净），对阿萨希毛孢子菌的体外抗真菌活性。

1 材料和方法

1.1 实验菌株和药物

环孢素、格尔德霉素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B和卡泊芬净均购自美国Sigma-Aldrich公司。ATCC 22019及CBS 2479（阿萨希毛孢子菌临床标准株）购自荷兰CBS真菌生物多样性中心；20株阿萨希毛孢子菌临床株（通过IGS1测序鉴定）均分离自毛孢子菌病患者，并保存于陆军总医院皮肤损伤修复研究所真菌实验室。

1.2 方法

根据美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 的标准M27-A3肉汤稀释法，使用96孔板(Costar)检测上述菌株对格尔德霉素、环孢素以及抗真菌药的体外抗真菌活性（MIC值）。35℃下孵育48 h后读取结果。三唑类抗真菌药物、环孢素、格尔德霉素和卡泊芬净MIC值的读取标准为：与生长对照孔相比，真菌生长≤50%的最低药物浓度；两性霉素B的MIC值读取标准为：与生长对照孔相比，真菌生长完全被抑制的最低药物浓度。棋盘微量液基稀释法检测上述2种抑制剂与常用抗真菌药的相互作用，联合用药时MIC值的读取标准均为：与生长对照孔相比，真菌生长≤50%的最低药物浓度。基于分级抑制浓度指数（fractional inhibitory concentration index，FICI）模型分析药物相互作用，FICI值=（联合作用时A药MIC值/单药时A药MIC值）+（联合作用时B药MIC值/单药时B药MIC）；FICI≤0.5 时，两药的相互作用判定为协同作用；0.5＜FICI≤4 时判定两药为无关作用；当 FICI＞4 时两药为拮抗作用。格尔德霉素、环孢素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬净和两性霉素B在本研究中所使用的药物浓度范围分别是：0.03～32.00 μg/ml、0.0125 ～ 200.0000 μg/ml、0.03 ～ 32.00 μg/ml、0.0075 ～ 8.0000 μg/ml、0.001 ～ 1.000 μg/ml、0.06 ～ 64.00μg/ml和 0.0075 ～ 8.0000 μg/ml。

2 结果

所有检测的阿萨希毛孢子菌菌株对临床常用抗真菌药的MIC值范围分别为：两性霉素B 0.25～4.0 μg/ml、 氟 康 唑 1.0 ～ 16.0 μg/ml、 伊 曲 康 唑0.25 ～ 1.00 μg/ml、伏立 康唑 0.03 ～ 0.25 μg/ml和卡泊芬净8～64 μg/ml （表1）。格尔德霉素对阿萨希毛孢子菌临床株具有一定的抗真菌作用，其MIC值范围为8～32 μg/ml，但环孢素未显示出对其明显的抗真菌作用，其MIC值范围为：所有临床株均200 μg/ml以上（表1）。对21株临床株的联合药敏实验显示多数具有一定的协同作用。两性霉素B联合格尔德霉素和两性霉素B联合环孢素显示出最好的协同作用，基于FICI模型，所有菌株均显示出协同作用（100%）；联合使用时，两性霉素B的MIC值分别降低了4～32倍和4～16倍，同时FICI的范围分别是0.092～0.5和0.062～0.258（表2）。同时，格尔德霉素与伊曲康唑和伏立康唑的联合也表现出良好的协同作用。基于FICI模型，多数菌株均显示出协同作用（均为90.48%）；联合使用时，伊曲康唑的MIC值从0.25～1.0 μg/ml降低到0.03～0.25 μg/ml，伏立康唑的MIC值从0.03～0.25 μg/ml降低到0.002～0.03 μg/ml（表2）。对于21株阿萨希毛孢子菌临床株，所有药物联合均未发现拮抗作用。

表1 格尔德霉素、环孢素和抗真菌药物对21株T. asahii的药物敏感性

表2 格尔德霉素及环孢素联合常用抗真菌药物对21株T. asahii的相互作用关系

3 讨论

近年来出现了阿萨希毛孢子菌临床耐药的报道，甚至还有多药耐药株的报道[11]。体外诱导实验也发现，在药物应激诱导压力下，阿萨希毛孢子菌可出现适应性耐药的表型[4]。由于侵袭性毛孢子菌病病死率高，但临床治疗选择少，目前指南中仅推荐三唑类抗真菌药用于侵袭性毛孢子菌病的系统治疗，所以需要尝试并探讨更多的临床治疗策略来提高治愈率，减少耐药菌株的出现。Hsp90是真核细胞应激反应的关键节点，其功能与病原真菌的毒力和耐药密切相关，其不同的客户蛋白参与不同的细胞应激反应应答，钙调磷酸酶是白念珠菌中最早被鉴定出的客户蛋白[7]。本研究通过体外药敏实验的方法初步探讨上述通路与阿萨希毛孢子菌耐药表型的关系。

既往研究发现酿酒酵母和白念珠菌的Hsp90可以稳定其钙调磷酸酶的催化亚基，敲除Hsp90基因会引起钙调磷酸酶表达下调，导致钙调磷酸酶功能的缺失，从而阻断药物应激后钙调磷酸酶依赖的细胞存活相关应激反应[12]。Cown和Lindquist[9]的研究发现，抑制Hsp90的功能可以阻断药物诱导酿酒酵母所产生的快速适应性耐药，从而进一步阻断诱导耐药子代获得较稳定的唑类耐药表型。本研究发现，单药应用格尔德霉素可明显抑制所有阿萨希毛孢子菌临床株，其MIC范围是4～32 μg /ml，这与既往对于念珠菌属临床株的体外药敏结果一致（MIC 3.2～ 12.8 μg/ml）[8]，但曲霉则表现出对其不敏感（MIC＞16 μg/ml）[13]。所有菌株对于环孢素的MIC值均＞200 μg/ml，这与上游阻断剂（格尔德霉素）的结果不一致，可能是由于Hsp90存在多种客户蛋白，环孢素阻断的钙调磷酸酶通路应答反应可能被其他客户蛋白有所代偿[14,15]。

既往体外药敏的研究发现，格尔德霉素或环孢素联合常用抗真菌药后，念珠菌属、曲霉属和隐球菌属的临床分离株对常用抗真菌药的MIC值均有不同程度的下降，药物之间显示出不同程度的协同效应[16-19]。而且对氟康唑耐药白念珠菌临床株的体外药敏实验发现，格尔德霉素和环孢素可显著降低氟康唑耐药白念珠菌临床株的MIC值（降低16倍以上）[9]。本研究发现，对于21株阿萨希毛孢子菌临床株（1株外购标准株和20株本实验室保存），格尔德霉素和环孢素均显示出与4种常用抗真菌药不同比例的协同效应（10种联合的协同率范围为33.33%～95.23 %）。虽然阿萨细毛孢子对于棘白菌素类抗真菌药先天耐药，且对于两性霉素B的敏感性不高，但一项巴西的研究发现，通过联合他克莫司可显著降低体外药敏实验中阿萨希毛孢子菌临床株对两性霉素B和卡泊芬净的MIC值[10]。本研究也得到了类似的结果，两性霉素B与格尔德霉素或环孢素的联合对于所有临床株（21株）均显示出协同作用（100%）。

一项对于大蜡螟白念珠菌感染模型的研究发现，同时给予Hsp90抑制剂（烯丙基氨基格尔德霉素）可以显著提高氟康唑的治疗效果，与单独使用氟康唑组相比，白念珠菌感染大蜡螟的存活率可提高90%以上[20]。另一项对于大蜡螟烟曲霉感染模型的研究也获得了类似的结果：与单独应用棘白菌素类抗真菌药组相比，联合Hsp90抑制剂可提高烟曲霉感染大蜡螟的存活率[21]。系统性念珠菌感染小鼠模型系统治疗浓度的氟康唑，如果同时抑制白念珠菌Hsp90基因的表达，与非治疗阳性对照组相比，感染小鼠肾脏的菌体负荷下降72.2%，而白念珠菌Hsp90基因未干预组感染小鼠肾脏的菌体负荷仅下降28.6%，说明白念珠菌Hsp90的表达有助于其在宿主体内时应对药物应激压力[20]。上述体内及体外研究结果提示Hsp90-钙调磷酸酯酶通路可能在病原真菌耐药中发挥重要作用，本研究的结果特别提示：在阿萨希毛孢子菌对两性霉素B的耐药中，Hsp90和钙调磷酸酶可能发挥了核心作用。

最新的治疗指南和我们既往的系统性回顾均推荐使用三唑类抗真菌药，特别是伏立康唑作为侵袭性毛孢子菌病治疗的首选用药，而其对两性霉素B治疗的反应不佳[2,3]，但研究发现两性霉素B联合氟康唑也可以达到良好的治疗效果[2]。基于本研究的结果，联合使用格尔德霉素或环孢素可以提高阿萨希毛孢子菌对于两性霉素B的敏感性；特别要强调本研究中联合用药所获得的环孢素 MIC值，多数在人体的安全血药浓度范围内（＜0.6 μg/ml）。环孢素是血液系统肿瘤治疗方案中的常用药，而血液系统肿瘤则是侵袭性毛孢子菌病最常见的基础疾病[2]，这可能为临床提供了另一个基于患者具体病情制定联合用药方案的策略。此外，三唑类抗真菌药的长期临床应用会引起耐药的出现[4]，Hsp90-钙调磷酸酶通路抑制剂的联合应用在提高抗真菌药效果的同时，可能减少长期应用三唑类抗真菌药出现获得性耐药的风险。

综上所述，本研究的结果证明Hsp90-钙调磷酸酶通路的抑制剂可以提高阿萨希毛孢子菌对常用抗真菌药的敏感性；但仍需要更多的体内和相关机制研究为未来的临床应用提供更多证据支撑。

【参 考 文 献】

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