EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

赵 犇

王 武1

李昌灵2

杨海麟1

(1.江南大学生物工程学院教育部工业微生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122；2.怀化学院生物与食品工程学院，湖南 怀化 418000)

随着世界范围内能源和资源的日益紧张，可再生能源与资源的研究与开发已成为关注热点。近几年，各国纷纷开始在微藻生物燃料和营养化学品领域谋求突破与发展：美国能源部宣布将投资1 800万美元用于藻类生物燃料与生物基产品研究；欧盟也积极投资藻类研究，旨在示范从藻种选育、培养条件优化、油脂提取、生物燃料生产等过程[1]。微藻在食品资源方面的利用涉及到裂殖壶菌，又称裂壶藻，是属于破囊壶菌科的单细胞海洋微藻，在一定的培养条件下，裂殖壶菌胞内油脂中二十二碳六烯酸(DHA，C22:6)含量较高，是值得研究和深度开发的生物合成DHA的优质种源[2]。

DHA为ω-3多不饱和脂肪酸，是一种重要的食品添加剂。它是大脑和视网膜的重要组成成分，还具有抗癌、消炎、预防心血管疾病等诸多功能[3-4]，其保健和医疗功效越来越受到重视。与传统的深海鱼油生产DHA的方式相比，裂殖壶菌发酵生产DHA具有培养简单、无季节波动、目的产物含量比高、无污染、无鱼腥味、成本低、不影响海洋生态等优点[5]，裂殖壶菌发酵生产DHA开始进入了工业化阶段[6]。

近些年，不断见到优化裂殖壶菌发酵，提高DHA产量的研究报道，如发酵培养基优化[7-9]、pH调控[10-11]、溶氧调控[12-14]、补料策略优化[15]等，靠传统发酵策略提高DHA的发酵生产强度的余地越来越小。而借助遗传育种手段，培育高产DHA的裂殖壶菌变异株仍有一定的发展空间，这也是发酵法提高DHA生产强度的上游基础。

裂殖壶菌基因组约39 Mb[16]，且裂殖壶菌代谢体系中脂肪酸合成途径复杂，既存在短链饱和脂肪酸的脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)合成途径，又存在长链不饱和脂肪酸的聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的合成通路[17]。尽管基因工程已普遍应用于微生物育种，并且在裂殖壶菌上也有所研究[18-19]，但考虑到裂殖壶菌复杂的遗传背景和尚不十分明晰的DHA合成途径，物理和化学诱变仍旧是可以考虑的选择。

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变为化学诱变，其作用机制是对DNA上高密度的碱基进行烷化作用，形成转换型或置换型突变[20]。目前EMS诱变在微生物育种以及农作物的优良品种选育上广泛应用，并获得了不错的效果[21-22]。常压室温等离子体(ARTP)是一种新型的诱变技术，它利用大气压辉光放电，产生多种活性粒子，作用于DNA上，引发基因突变[23]，它具有操作简单、可控性强、诱变效果好的特点，已逐步开始在科研与工业领域发挥重要作用[24]。由于单种诱变方法往往会使菌种产生抗性，或得到的诱变菌株性能不够稳定，在实际应用中往往采用2种或多种诱变方式相结合的方法进行诱变，即复合诱变[25]。

裂殖壶菌具有多层的细胞壁结构保护着胞内物质[26]，DHA的合成途径与代谢机制又十分复杂。以往针对裂殖壶菌的育种手段往往采用单一的诱变方法，这会产生诱变效果差、诱变效率低或诱变株性能不稳定、易退化等问题，如吕晓义等[27]仅仅利用60Co-γ射线辐照诱变裂殖壶菌，获得的诱变菌产量只有5.65 g/L；梁园梅等[28]采用单一UV诱变育种，获得的诱变株性能也没有突出的提升。欲获得性状良好、遗传稳定的裂殖壶菌高产DHA变异株，本研究将EMS-ARTP复合诱变方法应用于裂殖壶菌诱变育种，以期获得裂殖壶菌高产DHA诱变菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

菌株：裂殖壶菌(Schizochytriumsp.S31，ATCC 20888)，美国菌种保藏中心；

脂肪酸：标准品，美国Sigma公司；

正己烷：HPLC级，美国Fisher公司；

其他试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

离心机：3K15型，德国Sigma公司；

分光光度计：T6新世纪型，北京普禧通用仪器有限公司；

ARTP诱变仪：ARTP-III型，北京思清源生物科技有限公司；

气相色谱仪：GC-2010型，日本岛津公司。

1.1.3 培养基

790 By+固体培养基：葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨1 g/L、酵母粉1 g/L、琼脂20 g/L、海水晶17.5 g/L，121 ℃ 灭菌20 min；

种子培养基：葡萄糖30 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、海水晶15 g/L、VB10.05 g/L、VB60.05 g/L、VB120.000 5 g/L，115 ℃灭菌20 min；

发酵培养基：葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨5.6 g/L、谷氨酸钠20 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、硫酸镁7.2 g/L、硫酸钠 12.8g/L、氯化钙 0.4 g/L、海水晶17.5 g/L、VB10.1 g/L、VB60.1 g/L、VB120.001 g/L，115 ℃灭菌20 min；

0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2)：用双蒸水分别溶解24.00 g 磷酸二氢钠和28.39 g磷酸氢二钠至1 000 mL，然后混合280 mL磷酸二氢钠溶液和720 mL磷酸氢二钠溶液，121 ℃灭菌20 min，备用；

EMS溶液：取5 mL EMS原液，加入到15 mL预冷的乙醇溶液中，加盖并轻轻转动试管混合均匀。

1.2 方法

1.2.1 裂殖壶菌诱变菌株制备

(1) 菌悬液制备：将裂殖壶菌接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，28 ℃、200 r/min培养2 d。取1 mL培养液3 000 r/min离心5 min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2次后稀释至OD540为0.6～0.7(以PBS缓冲液为参比管)。

(2) EMS诱变株制备：在10 mL菌悬液中加入400 μL EMS溶液，轻轻摇匀后置于摇床，28 ℃、200 r/min条件下分别处理0，10，20，30，40，50，60 min(0 min为对照组)，取出后用5%硫代硫酸钠溶液洗涤2～3次终止反应，细胞用PBS缓冲液悬浮后吸取100 μL均匀涂布于固体培养基平皿上，置于30 ℃避光培养4 d。

(3) ARTP诱变株制备：吸取20 μL菌悬液，均匀涂抹在灭过菌的载物铁片上，将铁片置于ARTP诱变仪载物台上，用高纯氦气等离子体诱变分别处理0(对照组)，5，10，15，20，25 s，诱变参数为：电源功率100 W，氦气流量10 L/min，照射距离2 mm。ARTP诱变处理后，将铁片转移至装有1 mL PBS缓冲液的EP管中，震荡洗脱菌体。吸取100 μL菌体悬浮液均匀涂布于固体培养基平皿上，置于30 ℃避光培养4 d。

(4) EMS-ARTP复合诱变菌制备：将EMS诱变处理40 min 后制备的诱变菌悬液吸取100 μL均匀涂布于固体培养基平皿上，置于30 ℃避光培养4 d。混合平皿上长出的单菌落，并挑取一环，接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，按1.2.1(1)制备菌悬液，然后按1.2.1(3)经ARTP照射诱变15 s，获得EMS-ARTP复合诱变菌。其中对照组EMS处理时间0 min，ARTP照射时间0 s。

1.2.2 致死率、突变率计算

(1) 致死率计算：各诱变试验中，对对照组和诱变组固体培养基平皿上长出的菌落进行计数。按式(1)计算致死率。

(1)

式中：

rL——致死率，%；

N0——对照组菌落数；

Nm——诱变组菌落数。

(2) 突变率计算：各诱变试验中，选取致死率为80%～90%的处理时间作为最终诱变时间。在该诱变时间下对裂殖壶菌进行诱变处理，平板培养4 d后各组随机挑选50株菌，摇瓶培养120 h后测DHA产量，记产量高于原始菌株10%的诱变株为正突变株，产量低于原始菌株10%的诱变株为负突变株，并按式(2)计算突变率。

(2)

式中：

rm——突变率，%；

rP——正突变率，%；

rN——负突变率，%；

NP——正突变株菌株数；

NN——负突变株菌株数。

1.2.3 分析方法

(1) 生物量测定：各诱变株摇瓶培养120 h后，取5 mL发酵液于离心管中，8 000 r/min离心15 min，用双蒸水洗涤离心2次，冷冻干燥后称重计算生物量。

(2) 含油量测定：采用磷酸香草醛法[29]。

(3) 脂肪酸含量测定：采用气相色谱法[11]。

各诱变组选取5株DHA产量最高的菌株，其发酵平均水平作为该诱变方法下得到的高产菌的发酵水平。

2 结果与分析

2.1 诱变剂量的确定

2种诱变方法对裂殖壶菌的致死效应见图1。裂殖壶菌菌体的致死率与EMS处理时间存在明显的正相关效应，当EMS处理时间为40 min时，致死率达到87%。因此，选取40 min作为EMS处理的诱变剂量。

裂殖壶菌菌体的致死率随着ARTP照射时间的延长而显著增加。当照射时间在15 s以上时，致死率曲线趋于平缓，可能是细胞SOS修复机制的激活，突变率开始增加[30]。此时，裂殖壶菌的致死率达到80%以上。因此，选取15 s作为ARTP照射的诱变剂量。

从图1可以看出，对裂殖壶菌诱变的化学处理中，致死率对应于处理时间，形成较为平缓的上升曲线，而物理诱变中，致死率对应于照射时间则显得陡峭，说明准确掌控照射时间点非常重要。

图1 2种诱变方法对裂殖壶菌的致死效应Figure 1 Lethal effects of 2 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.2 EMS、ARTP和EMS-ARTP处理突变率的对比

分别使用EMS、ARTP和EMS-ARTP复合诱变3种诱变方法对裂殖壶菌进行诱变处理，并对诱变株进行摇瓶培养后测DHA产量，统计正、负突变率，结果见图2。3种诱变方法对裂殖壶菌的诱变效果呈现出一定的差异性。比较2种单因子诱变方法，裂殖壶菌突变率相差不大，介于40%与45%之间，但是在ARTP突变株中，正突变株的数量占到约60%，远高于负突变株；而在EMS突变株中，正、负突变株数量相当。EMS-ARTP复合诱变后，突变率达到55.7%，明显高于2种单因子诱变。其中正突变率达到32.2%，远远高于负突变率。

对裂殖壶菌而言，3种突变方法形成的突变率截然不同。表观上分析，推测EMS-ARTP复合诱变造成了更丰富的突变位点，因此回复突变的频率远远低于单因子诱变。

图2 3种诱变方法对裂殖壶菌诱变处理的突变率Figure 2 Mutation rate of 3 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.3 高产诱变株的关键发酵指标类比

从3种诱变方法获得的诱变株当中各挑选5株DHA产量最高的菌株，其发酵平均水平作为该诱变方法下得到的DHA高产菌株的发酵水平，结果见表1、2。从表1可知，与出发菌株相比，3种DHA高产菌株的生物量无明显的变化，而在含油量上，均有不同程度的提高，其中EMS诱变高产株含油量提升略高于ARTP诱变的，而复合诱变高产株含油量最高，达到51%。如表2所示，EMS诱变高产株的DHA较出发菌株无明显变化，而ARTP诱变高产株和复合诱变高产株DHA含量均得到了提升，分别约为40%和43%。基于上述变化，最终3种诱变菌的DHA产量均得到了一定程度的提升，其中EMS-ARTP复合诱变高产株的产量达到了7.2 g/L，提升了近36%，效果最明显。

3种DHA高产菌株的脂肪酸组成与出发菌株具有明显的差异，见表2。EMS诱变高产株的主要FAS产物，如C14∶0和C16∶0略有增加，主要PKS产物二十二碳五烯酸(DPA)出现下降现象；而ARTP和复合诱变高产株的FAS产物和PKS产物变化与EMS诱变高产株正好相反，如复合诱变高产株的FAS产物由原始菌株的42.3%下降到38.6%，而PKS产物由原始菌株的44.9%上升到55.2%。

表1不同高产DHA裂殖壶菌诱变株发酵性能分析†
Table 1 Analysis of fermentation performances on different high DHA yieldSchizochytriummutants (n=3)

菌株生物量/(g·L-1)含油量/%DHA产量/(g·L-1)w36．41±1．3645．51±2．085．28±0．35mEMS37．01±1．2848．45±2．585．74±0．33mARTP36．82±1．5547．94±2．676．28±0．28mEA36．88±1．2751．15±2．077．16±0．30

† w：原始菌株；mEMS：EMS诱变菌株；mARTP：ARTP诱变菌株；mEA：EMS-ARTP复合诱变菌株。

表2 不同高产DHA裂殖壶菌诱变株脂肪酸组成†Table 2 Fatty acids composition of different high DHA yield Schizochytrium mutants (n=3) %

† w：原始菌株；mEMS：EMS诱变菌株；mARTP：ARTP诱变菌株；mEA：EMS-ARTP复合诱变菌株。

2.4 高产诱变株遗传稳定性

将3种诱变方法获得的高产DHA诱变株进行连续传代培养，考察其遗传的稳定性，结果见图3。经过5代的传代培养，EMS诱变高产株和ARTP诱变高产株的发酵指标都出现了一定程度的退化，而复合诱变高产株的发酵指标保持相对稳定，其DHA含量为42.2%～43.3%，DHA产量为7.0～7.2 g/L，与一代菌无明显差异，遗传稳定性良好。

2.5 诱变方法对裂殖壶菌诱变机理

由3种诱变方法对裂殖壶菌的诱变结果分析可知，EMS产生的诱变效果弱于ARTP，而复合诱变的效果最好。EMS具有烷化DNA碱基的机理，可引发嘌呤和嘧啶转换[22]。在本试验中，EMS诱变高产株的含油量高于出发菌株，但DHA占总脂肪酸的相对含量与出发菌相比相差不大，说明其脂肪酸合成能力得到了提升，但DHA合成的特定代谢途径并未增强。

ARTP诱变为新型的诱变育种方法，它集合了质量、能量和电荷等损伤因素，产生不同的DNA损伤机制，遗传多样性更丰富[31]。Umu-test显示ARTP对基因的损伤能力远高于UV和常规化学诱变方法[32]。ARTP辐射的高活性粒子温度接近室温，不会对菌体产生热致死效应。在本试验中，将ARTP诱变技术应用于裂殖壶菌选育高产DHA菌株，取得了良好的效果，正突变率远远高于负突变率。通过发酵数据和脂肪酸组成的分析可以发现，ARTP高产株的含油量和DHA产量明显提升，而且脂肪酸组成中PKS产物也有了相应的提升，说明诱变株在合成脂肪酸前体物质的相关合成基因和PKS途径的特定基因都有可能发生了变异。

考虑到裂殖壶菌复杂的脂肪酸合成途径，单点或少数几个点的诱变往往不能对DHA的产量产生显著、稳定的改变。将化学诱变和物理诱变相结合，对裂殖壶菌进行EMS-ARTP复合诱变，诱变机制更多样，突变位点更丰富，获得DHA高产菌的概率也更大。通过EMS-ARTP复合诱变得到的高产菌株，DHA产量达到7.2 g/L。李慧玲等[33]采用DES-UV复合诱变结合丙二酸、碘乙酸联合筛选，得到诱变菌株XN001，其DHA产量为5.5 g/L；许永等[34]采用紫外诱变和喹禾灵筛选的方法，筛得的菌株OUC007，其DHA产量为1.2 g/L；袁军等[35]通过ARTP诱变与强氧化剂施压筛选得到的菌种D32，其DHA产量达到7.3 g/L。通过本试验的诱变方法筛选得到的高产诱变菌株，在未使用任何筛选试剂的情况下，已获得较高DHA产量。该产量与近期报道的相同菌种、相同发酵规模的数据相比，已十分具有竞争力(表3)。后期经过合适的筛选方法和发酵培养优化后，有望进一步提高DHA生产能力。

表3 不同破囊壶菌DHA产量和DHA含量比较Table 3 Comparative results of DHA production and percentage among different studies by thraustochytrids

图3 高产诱变株传代次数对发酵指标的影响Figure 3 Effects ofculture passages on fermentation performance of high DHA yield Schizochytrium mutants

3 结论

将EMS-ARTP复合诱变的方法应用于裂殖壶菌诱变选育高产DHA菌株，并对复合诱变获得的DHA高产菌株与单因子诱变高产菌株进行比较分析得出，EMS-ARTP复合诱变高产菌株无论在DHA产量还是在遗传稳定性上，都优于单因子诱变。再加上后期的理性筛选技术及定向施压培养的应用，有望进一步提高裂殖壶菌合成DHA的产率，继而提高工业化生产DHA的效能。

[1] 中国科学院.能源科技领域发展观察[M].北京: 科学出版社, 2016: 303-315.

[2] REN Lu-jing, SUN Xiao-man, JI Xiao-jun, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid synthesis by manipulation of antioxidant capacity and prevention of oxidative damage inSchizochytriumsp[J].Bioresource Technology, 2017, 223: 141-148.

[3] D'ELISEO D, VELOTTI F.Omega-3 fatty acids and cancer cell cytotoxicity: implications for multi-targeted cancer therapy[J].J Clin Med, 2016, 5(2): 15-43.

[4] HADLEY K B, BAUER J, MILGRAM N W.The oil-rich algaSchizochytriumsp.as a dietary source of docosahexaenoic acid improves shape discrimination learning associated with visual processing in a canine model of senescence[J].Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, 2017, 118: 10-18.

[5] JIANG Yue, FAN King-wai, WONG Rsz-yeung, et al.Fatty acid composition and squalene content of the marine microalgaSchizochytriummangrovei[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(5): 1 196-1 200.

[6] HAUVERMALE A, KUNER J, ROSENZWEIG B, et al.Fatty acid production inSchizochytriumsp.: Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase[J].Lipids, 2006, 41(8): 739-747.

[7] GAUNT L F, BEGGS C B, GEORGHIOU G E.Bactericidal action of the reactive species produced by gas-discharge nonthermal plasma at atmospheric pressure: A review[J].Ieee Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1 257-1 269.

[8] REN Lu-jing, SUN Li-na, ZHUANG Xiao-yan, et al.Regula-tion of docosahexaenoic acid production bySchizochytriumsp.: effect of nitrogen addition[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2014, 37(5): 865-872.

[9] SINGH D, BARROW C J, PURI M, et al.Combination of calcium and magnesium ions prevents substrate inhibition and promotes biomass and lipid production in thraustochytrids under higher glycerol concentration[J].Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts, 2016, 15: 202-209.

[10] GANUZA E, ANDERSON A J, RATLEDGE C.High-cell-density cultivation ofSchizochytriumsp.in an ammonium/pH-auxostat fed-batch system[J].Biotechnology Letters, 2008, 30(9): 1 559-1 564.

[11] ZHAO Ben, LI Ya-fei, MBIFILE M D, et al.Improvement of docosahexaenoic acid fermentation fromSchizochytriumsp.AB-610 by staged pH control based on cell morphological changes[J].Engineering in Life Sciences, 2017, 17(9): 981-988.

[12] CHANG Gui-fang, WU Juan, JIANG Cui-hong, et al.The relationship of oxygen uptake rate and k(L)a with rheological properties in high cell density cultivation of docosahexaenoic acid bySchizochytriumsp.S31[J].Bioresource Technology, 2014, 152: 234-240.

[13] LEWIS K D, HUANG Wei-feng, ZHENG Xiao-hui, et al.Toxicological evaluation of arachidonic acid (ARA)-rich oil and dcosahexaenoic acid (DHA)-rich oil[J].Food and Chemical Toxicology, 2016, 96: 133-144.

[14] QU Liang, JI Xiao-jun, REN Lu-jing, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid production bySchizochytriumsp.using a two-stage oxygen supply control strategy based on oxygen transfer coefficient[J].Letters in Applied Microbiology, 2011, 52(1): 22-27.

[15] HUANG Ting-yen, LU Wen-chang, CHU I-ming.A fermentation strategy for producing docosahexaenoic acid in AurantiochytriumlimacinumSR21 and increasing C22:6 proportions in total fatty acid[J].Bioresource Technology, 2012, 123: 8-14.

[16] JI Xiao-jun, MO Kai-qiang, REN Lu-jing, et al.Genome sequence ofSchizochytriumsp.CCTCC M209059, an effective producer of docosahexaenoic acid-rich lipids[J].Genome Announc, DOI: 10.1128/genomeA.00819-15.

[17] METZ J G, ROESSLER P, FACCIOTTI D, et al.Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes[J].Science, 2001, 293(5 528): 290-293.

[18] REN Lu-jing, ZHUANG Xiao-yan, CHEN Sheng-lan, et al.Introduction of omega-3 desaturase obviously changed the fatty acid profile and sterol content ofSchizochytriumsp[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(44): 9 770-9 776.

[19] YAN Jin-fei, CHENG Ru-bin, LIN Xiang-zhi, et al.Overexpression of acetyl-CoA synthetase increased the biomass and fatty acid proportion in microalgaSchizochytrium[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(5): 1 933-1 939.

[20] 崔清志, 刘晓虹, 陈惠明.EMS诱变技术研究进展[J].湖南农业科学, 2013(5): 7-9, 13.

[21] 敬樊, 王亮明, 武军, 等.利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导小麦-华山新麦草染色体易位的研究[J].农业生物技术学报, 2015(5): 561-570.

[22] 降云峰, 刘永忠, 李万星, 等.甲基磺酸乙酯诱变技术在大豆育种上的应用[J].园艺与种苗, 2012(6): 12-15.

[23] ZHANG Xue, ZHANG Xiao-fei, LI He-ping, et al.Atmospheric and room temperature plasma (ARTP) as a new powerful mutagenesis tool[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(12): 5 387-5 396.

[24] 张雪, 张晓菲, 王立言, 等.常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J].化工学报, 2014(7): 2 676-2 684.

[25] 任少雄, 王丹.植物理化复合诱变育种技术研究进展[J].安徽农业科学, 2009(20): 9 345-9 349.

[26] DARLEY W M, PORTER D, FULLER M S.Cell wall composition and synthesis via Golgi-directed scale formation in the marine eucaryote,Schizochytriumaggregatum, with a note on Thraustochytrium sp[J].Archiv Für Mikrobiologie, 1973, 90(2): 89-106.

[27] 吕小义, 付杰, 尹佳, 等.高产DHA裂壶藻突变株的选育[J].中国酿造, 2015(4): 106-109.

[28] 梁园梅, 刘瑛, 李晶晶, 等.高产DHA破囊壶菌Aurantiochytriumsp.PKU#SW7诱变株的筛选[J].微生物学通报, 2016(2): 457-464.

[29] 罗玮, 顾秋亚, 钟湘南, 等.1种快速检测微藻油脂的新方法[J].食品与发酵工业, 2014(12): 165-168.

[30] FU Jie, CHEN Tao, LU Hao, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid production by low-energy ion implantation coupled with screening method based on Sudan black B staining inSchizochytriumsp[J].Bioresource Technology, 2016, 221: 405-411.

[31] LI He-ping, WANG Zhi-bin, GE Nan, et al.Studies on the physical characteristics of the radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge plasmas for the genome mutation of methylosinustrichosporium[J].Ieee Transactions on Plasma Science, 2012, 40(11): 2 853-2 860.

[32] ODA Y, NAKAMURA S, OKI I, et al.Evaluation of the new system (umu-test) for the detection of environmental mutagens and carcinogens[J].Mutation Research, 1985, 147(5): 219-229.

[33] 李慧玲, 刘永梅.诱变选育高产DHA裂殖壶菌突变株[J].食品科技, 2015(9): 12-16.

[34] 许永, 臧晓南, 徐涤, 等.裂殖壶菌诱变筛选的研究[J].中国海洋大学学报：自然科学版, 2012(12): 54-58.

[35] 袁军, 赵犇, 孙梦玉, 等.常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育高产DHA的裂殖壶菌突变株[J].生物技术通报, 2015(10): 199-204.

[36] CHEN Wei, ZHOU Peng-peng, ZHU Yuan-min, et al.Improvement in the docosahexaenoic acid production ofSchiz-ochytriumsp.S056 by replacement of sea salt[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2016, 39(2): 315-321.

[37] CHANG Gui-fang, GAO Ni-si, TIAN Gui-wei, et al.Improvement of docosahexaenoic acid production on glycerol bySchizochytriumsp S31 with constantly high oxygen transfer coefficient[J].Bioresource Technology, 2013, 142: 400-406.