细菌纤维素固定化漆酶对活性艳蓝KN-R脱色的研究1

吴月红， 袁海彬， 洪 枫， 陈 琳*

（1. 东华大学 生态纺织教育部重点实验室，上海 201620；2. 东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620）

印染废水严重污染水体环境[1-2]。蒽醌染料是一种广泛使用的染料，但其结构很稳定，不易脱色[3]。目前常用的脱色方法有物理法、化学法和生物法等[4]，生物酶法由于绿色环保的特点备受关注[5]。漆酶（Laccase;EC 1.10.3.2.）是一种含铜的多酚氧化还原酶[6]，该酶对染料脱色的研究较多[7-8]。在反应过程中，漆酶以氧气作为第二底物被还原成水[9-11]。在细菌纤维素（Bacterial Cellulose, BC）固定化漆酶方面的相关研究较多：袁海彬等[12]采用不同菌株来源的BC固定化漆酶并比较了固定化酶的催化效率；Zou等[13]使用BC微球为载体固定化漆酶，Chen等[14]用BC模块固定化真菌漆酶并对该固定化酶进行了表征；固定的漆酶可用于处理染料废水[15-16]。BC是一种生物合成的纤维素高聚物，具有可生物降解、多孔和比表面积大等特性[17]，是一种理想的固定化载体。

本文以 BC膜固定化漆酶，并进行填柱组装生物反应器，研究该固定化酶及生物反应器对蒽醌染料——活性艳蓝KN-R的降解脱色效果。与之前的报道相比，本研究是首次采用以BC膜固定化的漆酶填充组装生物反应器，并对活性艳蓝KN-R进行脱色。在物理吸附和生物酶降解共同作用下，大大增加了脱色效果。

1 实验

1.1 材料与试剂

漆酶购自山东苏柯汉生物工程股份有限公司，由白腐真菌发酵而来，酶活655.6 U/g；2,2ʼ-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（简称 ABTS）购自上海源叶生物科技有限公司；活性艳蓝 KN-R染料购自国药集团化学试剂有限公司，配制200 mg/L活性艳蓝KN-R储备液待用。其它所用试剂均为分析纯。

BC膜由实验室发酵制备而来：将斜面保藏的木醋杆菌（Komagataeibacter xylinus ATCC 23770）用接种环接入种子培养基中，在30℃和160 r/min的摇床中活化培养20 h，然后按5%（V/V）的接种量接入发酵培养基，最后放入30℃恒温培养箱中静置发酵培养12 d，木醋杆菌将在气液界面分泌纤维素形成细菌纤维素膜。实验所用培养基组成为：葡萄糖25 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，培养基配好后用柠檬酸将pH值调至5.0，在115℃高压灭菌锅下灭菌30 min。

将获得的细菌纤维素膜用0.5%（w/V）的氢氧化钠水溶液在80℃下浸泡2 h，分别连续处理3次以上，再用去离子水浸泡2 d以上，纯化后的膜放入4℃冰箱储存备用。称取1 g漆酶（酶活为655.6 U/g）溶于10 mL NaAC-HAC（0.2 mol/L，pH5.0）水溶液中配置漆酶溶液，放入4℃冰箱待用。

1.2 漆酶的固定化及酶活测定

将细菌纤维素膜剪成大小均匀的块状（1 cm×1 cm）在冷冻干燥机中冻干，冻干后的膜块浸没于漆酶溶液中，在恒温振荡水浴锅中，于室温和100 r/min速率下吸附2 h以上，酶分子通过物理吸附负载到细菌纤维素膜上，完成固定化，取出后用NaAc-HAc缓冲溶液漂洗3次，于4℃冰箱中保存。

游离酶活力的测定：ABTS为反应底物[18]，反应体系总体积为3 mL，包含1 mL NaAc-HAc缓冲溶液（0.2 mol/L，pH5.0），1 mL ABTS（1 mM，εABTS＝36 000 M-1cm-1），和1 mL适量稀释漆酶水溶液，在紫外-可见分光光度计中于420 nm处测其3 min内吸光值的变化，计算斜率k值，求其酶活。固定化酶酶活测定体系包含1 mL NaAc-HAc缓冲溶液（0.2 mol/L，pH5.0），1 mL ABTS（1 mM）和适量质量固定化酶。一个酶活单位定义为每分钟内生成1 μmol ABTS游离基所需的酶量。游离酶及固定化酶的计算公式如下式（1）所示。

其中：V总为反应体系的总体积，V酶为反应酶液的体积，Δt＝3 min，ΔA＝3 min内吸光值的变化量，ε＝3.6×104M-1cm-1。

其中：V总为反应体系的总体积，m载体为固定化酶载体的质量，Δt＝3 min，ΔA＝3 min内吸光值的变化量，ε＝3.6×104M-1cm-1。

1.3 固定化漆酶对活性艳蓝KN-R溶液的脱色

将5.0 g固定化酶湿膜块填充到层析柱中（1.6×40 cm），塞紧，每次填充的高度保持一致，在柱中缓慢加入15 mL浓度为50 mg/L的活性艳蓝KN-R染料水溶液，脱色后的溶液将从层析柱底部流出。在597 nm处测得染料溶液脱色之前的吸光度为A0，脱色之后的吸光度为A1，根据公式（3）算出脱色率：

1.4 活性艳蓝KN-R脱色前后的紫外可见吸收光谱

用固定化酶对活性艳蓝KN-R溶液进行脱色，将脱色前后的溶液在紫外-可见分光光度计中进行200～700 nm全波长扫描，观察溶液脱色前后的吸收峰变化。

1.5 固定化漆酶对活性艳蓝KN-R的降解动力学

将湿重为1.5 g的固定化酶加入15 mL浓度为50 mg/L的活性艳蓝KN-R溶液中进行脱色，分别测定10、30、60、120、180、360、720和1440 min时溶液的吸光度，根据活性艳蓝KN-R的标准曲线计算出不同时间段脱色后溶液的浓度，然后分别进行一级和二级动力学方程模拟。

1.6 BC 膜对活性艳蓝KN-R的吸附等温线

配制浓度为10、20、50、100、150和200 mg/L的活性艳蓝KN-R溶液，取湿重为5 g的细菌纤维素膜块分别加入到15 mL各个浓度的活性艳蓝KN-R溶液中，室温下进行脱色，测定活性艳蓝KN-R脱色后的溶液的吸光度，根据活性艳蓝KN-R溶液的标准曲线计算出脱色后的溶液的浓度，然后分别进行Langmuir吸附等温线和Freundlich吸附等温线模拟。

1.7 不同因素对活性艳蓝KN-R脱色率的影响

将湿重为5.0 g的BC膜吸附不同酶活浓度的游离酶，制备固定化酶后，将总酶活为0、14.2、28.3、56.8、84.9、113.2和141.6 U的固定化酶分别放入15 mL活性艳蓝KN-R溶液中，反应总体系均为25 mL，探究不同的固定化酶的活力对脱色率的影响。加入与固定化酶酶活相同的游离酶对活性艳蓝 KN-R脱色，比较固定化酶与游离酶在降解率和反应速率上的差异。

将湿重分别为0.5、1.0、2.5、5.0、7.5和10 g的固定化酶膜块填充到层析柱中，探究不同的层析柱填充量对脱色率的影响。

配制浓度为10、20、50、100、150和200 mg/L的活性艳蓝KN-R染料溶液，探究不同的染料浓度对脱色率的影响。

调节活性艳蓝KN-R溶液的pH分别为3、5、7、9和11，探究不同的pH对脱色率的影响。

将湿重为5.0 g的固定化酶对活性艳蓝KN-R溶液重复脱色5次，探究固定化酶的重复使用性。

2 结果与讨论

2.1 活性艳蓝KN-R脱色前后的紫外可见吸收光谱

图1为活性艳蓝KN-R脱色前后的紫外可见吸收光谱图。

从图 1可以看出，部分脱色的活性艳蓝KN-R溶液在可见和紫外光区的吸收峰都减小，完全脱色的活性艳蓝KN-R溶液的吸收峰则几乎完全消失，说明染料的发色基团被破坏，活性艳蓝KN-R发生了降解而脱色。

2.2 固定化漆酶对活性艳蓝KN-R的降解动力学

图1 活性艳蓝KN-R脱色前后的紫外可见吸收光谱图

为了更好地了解固定化漆酶对活性艳蓝 KN-R的降解过程，对降解过程分别进行一级和二级动力学表征，两种动力学方程如下式（1）和式（2）[19]：

由图2可以看出，二级动力学的线性更好，固定化酶对活性艳蓝KN-R的降解更符合二级动力学模拟。

图2 动力学模拟（a）一级动力学模拟、（b）二级动力学模拟

2.3 BC 膜对活性艳蓝KN-R的吸附等温线

细菌纤维素膜载体对染料有一定的吸附，对吸附过程分别进行Langmuir和Freundlich吸附等温线模拟，两种吸附等温线方程如下式（3）和式（4）[20]：

式中：Ce为吸附平衡浓度（mg/L），qe为细菌纤维素膜对活性艳蓝 KN-R的吸附量（mg/g），qm为最大吸附量（mg/g），KL、KF、n为吸附速率常数。从图 3可以看出，载体细菌纤维素膜对活性艳蓝 KN-R的吸附更符合Freundlich吸附等温线，说明细菌纤维素膜对活性艳蓝KN-R的吸附不属于单分子层吸附。

图3 吸附等温线模拟（a）Langmuir 吸附、（b）Freundlich吸附

2.4 不同因素对活性艳蓝KN-R溶液脱色率的影响

2.4.1 酶活对活性艳蓝KN-R染料脱色率的影响

从图 4可以看出，当未加酶时，溶液的脱色率为23.4%，即没有固定化酶时细菌纤维素膜对活性艳蓝KN-R的吸附量，表明细菌纤维素膜本身对活性艳蓝KN-R染料有一定的吸附率。一定范围内随着同样质量BC载体上漆酶量的增加，固定化酶活增大，艳蓝脱色率增加，随着游离酶的酶活增加，艳蓝脱色率同样增加。当加入的同样质量BC固定化酶的活力为84.9 U时，此时反应体系酶活为3.4 U/mL，脱色率最大为73.5%，而同等酶活的游离酶脱色率为20.5%，计算得出，固定化酶比游离酶的降解率提高了2倍，反应速率提高了3倍，染料可能会破坏酶分子，BC膜载体为漆酶提供了相对稳定的环境，因此固定化酶的效率比游离酶高。继续增加固定化酶酶活，脱色率会有所下降，这可能是由于当单位质量的BC膜上增加酶量时，漆酶对活性艳蓝KN-R的降解效率会增加，但是过量的酶占据了BC膜上的吸附位点，减小了BC膜对染料分子的吸附，最终导致脱色率有所下降。

图4 酶活对脱色率的影响

2.4.2 层析柱填充的固定化酶量对脱色率的影响

图5a中是总的脱色率和BC膜对艳蓝的吸附，图5b中脱色率为扣除BC膜吸附后的值。加入的固定化酶填充量在0.5～10 g范围内，随着层析柱中填充的固定化酶增多，脱色率增大。在加入湿重为0.5 g的固定化酶时，活性艳蓝KN-R总的脱色率为39.9%，此时BC膜对染料的吸附量较少为5.5%，增加层析柱中固定化酶的填充量，脱色率迅速增加，当固定化酶的量增加到5.0 g时，BC膜对染料的吸附量为23.9%，总的脱色率可以达到 87.5%。继续增加固定化酶的填充量，BC膜的吸附增加很多，一定时间内酶的降解率增加缓慢，因此扣除BC膜的吸附后，图5b中显示固定化酶的降解率下降，但是被BC膜吸附的染料最终也会被膜上的酶降解。综合考虑BC膜的吸附和酶的降解，比较理想的固定化酶填充量为5.0 g。

图5 固定化酶量对脱色率的影响（a）固定化酶质量、（b）固定化酶酶活

2.4.3 染料浓度对活性艳蓝KN-R染料脱色的影响

从图6可以看出，当活性艳蓝KN-R染料的浓度小于50 mg/L时，增加染料的浓度，催化反应速度增大，脱色率上升，当染料浓度达到50 mg/L时脱色率最大，为81.1%，当浓度超过50 mg/L时，脱色率有所降低。适当增加染料浓度，脱色率会升高，说明酶未被染料分子所饱和，但染料浓度达到50 mg/L时，一定时间内酶的活性中心完全被底物占据，此时继续增加染料浓度也不会增加酶与染料的中间产物，而BC膜对染料的吸附率也是有限的，所以当底物浓度太大时脱色率会降低。

图6 染料浓度对脱色率的影响

图7 pH对脱色率的影响

2.4.4 pH 对活性艳蓝染料KN-R染料脱色的影响

从图7可以看出，当pH为3～5时，随着pH的增加，脱色率增大，pH为5时活性艳蓝KN-R的脱色率最高为95.2%，pH值大于7后，脱色率快速下降，当pH增大到11时，脱色率仅为34.3%，说明偏酸性条件适合漆酶对活性艳蓝 KN-R染料的脱色，而碱性条件下的脱色效果非常差，这与之前的报道基本一致[21]，但是有报道说漆酶对不同的染料脱色的最佳pH是不同的[22]。

2.4.5 固定化酶对活性艳蓝KN-R脱色的重复使用次数

从图8可以看出，随着重复脱色的次数增多，脱色率下降，在重复脱色3次后，脱色率降为原来的一半左右，在重复脱色5次以后，活性艳蓝KN-R的脱色率仅为12.2%。随着重复脱色的次数增加，载体膜上越来越多的染料以及染料分解后的产物，阻碍了固定化膜对活性艳蓝KN-R的吸附，膜上固定化酶的酶活也逐渐失活减小，脱色变得越来越困难，脱色率降低。

图8 固定化酶的重复使用次数

3 结论

本实验主要研究了细菌纤维素膜固定化漆酶对活性艳蓝KN-R的脱色过程，主要结论如下：

1）BC膜为载体固定化漆酶对活性艳蓝KN-R有良好的脱色效果，与游离酶相比降解率提高了2倍，反应速率提高了3倍；固定化酶对活性艳蓝KN-R的降解符合二级动力学方程；BC膜对活性艳蓝KN-R的吸附符合Freundlich吸附等温线；脱色后的活性艳蓝KN-R溶液的紫外可见吸收光谱的吸收峰几乎完全消失，说明染料发生降解而脱色。

2）固定化酶对活性艳蓝KN-R的脱色在偏酸性条件下较好，pH为5时，脱色率为95.2%；染料浓度为50 mg/L时脱色效果较好；反应体系中加入84.9 U的固定化酶时，此时反应体系酶活为3.4 U/mL，脱色率最高为73.5%；随着固定化酶重复脱色次数的增加，脱色率会逐渐降低。

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