间苯三酚法快速测定玉米芯水解液中单糖含量1

高晓峰 ， 兰 萌 ， 杨明琰 ,2*， 段 洁 ， 樊 成

（1. 长安大学环境科学与工程学院，陕西 西安 710054；2. 旱区地下水文与生态效应教育部重点实验室，陕西 西安 710054；3. 陕西省产品质量监督检验研究院，陕西 西安 710048）

近年来，随着人口增长、土地资源紧张等问题日益严重，使得以玉米、木薯等粮食作物作为主要原料的第一代生物质能源成本日益走高，同时面临“与人争粮，与粮争地”困境，发展前景受到限制。木质纤维素原料包括农业秸秆、城市固体废弃物、办公废纸、杂草、锯末等，与粮食原料相比，其原料更丰富，价格更低廉，以其作为原料生产液体替代燃料的第二代生物质能源极具发展前景，在美国、巴西及欧洲已形成新的可再生能源产业[1]。木质纤维素主要由木质素、半纤维素、纤维素组成，其生物转化包括预处理、酶解和发酵三个阶段，木质纤维素酶解液中含有大量的葡萄糖和木糖，其含量是衡量木质纤维预处理方法有效性的重要指标，因此在实验室建立快速准确的单糖测定方法十分重要。

目前实验室测定单糖常用的方法有3,5-二硝基水杨酸比色（DNS）法[2]、酶标法、高效液相色谱（HPLC）法[3-4]、间苯三酚法[5]等。其中DNS 法易受其它还原糖的干扰，选择性不高，不能直接测定水解液中的单糖含量；现有的酶标法只能用于测定葡萄糖含量；HPLC 法对检测条件要求高，测定周期长，不便于实验室快速测定；间苯三酚法是由Eberts T J[6]等提出的一种木糖测定方法，可用于临床血液、尿液中木糖的快速检测及发酵液中木糖的测定[7-10]，具有灵敏度高、操作简便等优点。本实验采用间苯三酚-浓硫酸显色法建立双波长分光光度法测定溶液中木糖和葡萄糖的含量，对该方法的最佳测定条件及溶液中木糖及葡萄糖的相互影响进行了分析，探究其用于测定木质纤维素酶解液中木糖和葡萄糖的可行性。

1 实验

1.1 玉米芯水解液

1.1.1 玉米芯原料

玉米芯原料来自西安市长安区，自然干燥，用粉碎机粉碎后过20目筛备用。

1.1.2 酸-碱耦合处理酶解液制备

玉米芯原料用2%稀硫酸120℃处理60 min，得酸水解液，抽滤，残渣用1%氢氧化钠60℃处理2 h后，按15 FPU/g葡聚糖加入纤维素酶Cellic®CTec2，50℃，180 r/min酶解72 h得酸-碱耦合处理酶解液。

1.2 仪器与试剂

紫外可见分光光度计（L6S型，上海仪电分析仪器有限公司），电子天平（BS-224-S，赛多利斯科学仪器有限公司）。

间苯三酚、无水乙醇、浓硫酸、D-木糖标准品、葡萄糖标准品，均为分析纯。

纤维素酶Cellic®CTec2：由Novozymes North America（由丹麦诺维信酶制剂公司提供），酶活性147 FPU/mL。

1.3 溶液的配制

分别称取0.030 0 g烘干至恒重的木糖和葡萄糖，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配制成300 µg/mL的木糖及葡萄糖标准溶液，备用。

显色剂的配制：2%的间苯三酚的乙醇溶液与浓硫酸体积比为1∶1混合。

1.4 实验方法

1.4.1 吸收光谱的测定

分别精确移取200 µL木糖和葡萄糖标准溶液，加蒸馏水至1 mL，再各加入5 mL显色剂，混匀，100℃水浴加热10 min，冷却至室温后再加入10 mL蒸馏水混匀，在波长为380～600 nm范围内进行扫描，以蒸馏水为空白对照。

1.4.2 显色时间对吸光度的影响

分别准确吸取200 μL木糖和葡萄糖标准溶液于试管中，加蒸馏水至1 mL，再各加入5 mL显色剂，混匀，100℃水浴显色2、5、10、15、20、25 min，方法同“1.4.1”，分别在木糖和葡萄糖的最大吸收波长下测定吸光度值，确定最佳水浴加热时间。

1.4.3 标准曲线的绘制

分别移取300 µg/mL葡萄糖和木糖标准溶液0.1～1.0 mL，其它方法同“1.4.1”，分别在葡萄糖和木糖最大吸收波长下测定吸光度值，制作标准曲线。

1.4.4 显色剂放置时间的影响

配制显色剂，分别放置 0、24、48、72 h，按“1.4.1”方法分别测定木糖和葡萄糖含量，确定显色剂放置时间对测定结果的影响。

1.4.5 稳定性试验

分别移取200 μL木糖和葡萄糖的标准溶液，测定方法同“1.4.1”，显色后每隔10 min测定一次，测定至一个小时，检验显色物质的稳定性。

1.4.6 回收率试验

分别移取150 μL木糖和葡萄糖标准溶液于试管中，再向其中分别加入10～90 μL的木糖和葡萄糖标准溶液，测定方法同“1.4.1”，测定木糖和葡萄糖的含量，计算木糖和葡萄糖的回收率。

1.4.7 精密度试验

分别精确移取木糖和葡萄糖的标准液200 μL于试管中，测定方法同“1.4.1”，同时做5份平行样品，测定木糖和葡萄糖的含量，并计算其标准偏差和相对标准偏差。

1.4.8 葡萄糖和木糖之间相互的干扰

取600 μL木糖标准液，分别精确加入0、50、100、150、200、250 μL葡萄糖标准液，稀释10倍，测定方法同“1.4.1”，计算木糖的浓度，确定溶液中葡萄糖对木糖的影响。

同理，分别取600 μL葡萄糖标准液，分别精确加入0、50、100、150、200、250 μL木糖标准液稀释10倍，测定方法同“1.4.1”，计算葡萄糖的浓度，确定溶液中木糖对葡萄糖的影响。

1.4.9 玉米芯水解样品中葡萄糖和木糖含量的测定

将待测玉米芯酸水解液稀释到合适的浓度，测定水解液中木糖的含量；将待测玉米芯酸碱耦合处理酶解液稀释至合适的浓度，测定酶解液中葡萄糖的含量。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱的测定

以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制木糖和葡萄糖的吸收光谱图，结果如图1所示。从图1可以看出，木糖和葡萄糖分别与显色剂反应后，分别在波长为 444 nm、420 nm处有最大吸收峰，因此，选择444 nm作为测定木糖的波长，选择420 nm作为测定葡萄糖的波长。

图1 葡萄糖和木糖显色液的吸收光谱扫描

图2 木糖葡萄糖标准曲线

2.2 显色时间对吸光度的影响

分别测定葡萄糖和木糖在不同显色时间的吸光度，以确定显色时间对吸光度的影响，结果如图2所示。由图2可知，吸光度在显色2～10 min内上升较快，10 min以后变化趋于缓慢，综合考虑，选10 min为最佳水浴时间。

2.3 木糖和葡萄糖标准曲线

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制木糖和葡萄糖标准曲线，结果如图 3所示。由图可知木糖和葡萄糖浓度在20～120 µg/mL范围内与吸光度呈线性关系，其R2值分别为0.995 9、0.998 2，说明该方法具有良好的线性关系。

2.4 显色剂放置时间的影响

显色剂配制后放置0、24、48、72 h后再测定，研究其放置时间对测定结果的影响。结果表明，显色剂放置 72 h后，木糖和葡萄糖的测定结果分别为新配制的 95.48%、95.57%，说明显色剂放置72 h后对两者测定结果影响不大。

图3 显色时间对吸光度的影响

2.5 稳定性试验

木糖及葡萄糖溶液显色后，每隔10 min测定一次直至1 h，确定显色物质的稳定性。结果表明，放置1 h后木糖和葡萄糖的吸光度分别为最初的102.92%、101.40%，表明在显色后1 h范围内的测定数据都是准确的。

2.6 回收率试验

在标准木糖和葡萄糖溶液中分别加入一定量的木糖和葡萄糖，再分别测定其含量、计算回收率，结果如表1、2所示。由表1、2可知，木糖的平均回收率为100.82%，RSD为0.32%，葡萄糖的平均回收率为100.65%，RSD为0.46%。

表1 木糖回收率试验结果

表2 葡萄糖回收率试验结果

2.7 精密度试验

对同一样品的5份平行样分别进行测定，木糖测定结果如表3所示，木糖浓度的平均值为60.37 µg/mL，标准偏差为 0.8432 µg/mL，RSD为 1.3967%，葡萄糖测定结果如表 4所示，葡萄糖浓度的平均值为60.39 µg/mL，标准偏差为0.8430 µg/mL，RSD为1.3959%。表明这种方法的重复性高，准确性高。

表3 木糖精密度试验结果

表4 葡萄糖精密度试验结果

2.8 木糖与葡萄糖的相互干扰试验

由于玉米水解液中存在大量的木糖和葡萄糖，为了保证测定的精确性，对溶液中的葡萄糖和木糖之间是否存在干扰进行了验证，结果如表5、6所示。由表5、6可知，当溶液中两者浓度较接近时，如600 µg/mL的木糖标准溶液中加入250 µg/mL的葡萄糖时，木糖的测定值是其标准值的129.13%，结果明显偏大。而600 µg/mL的木糖标准溶液中加入50 µg/mL的葡萄糖时，木糖的测定结果是其标准植的103.62%。同样，600 µg/mL的葡萄糖标准溶液中加入250 µg/mL的木糖时，葡萄糖的测定值是其标准值的127.15%，结果明显偏大。而600 µg/mL的葡萄糖标准溶液中加入50 µg/mL的木糖时，葡萄糖的测定结果是其标准植的102.02%。说明只有当溶液中木糖和葡萄糖的浓度相差10倍以上时，该方法才能用于对溶液中木糖和葡萄糖的测定。

表5 葡萄糖对木糖测定的影响

表6 木糖对葡萄糖测定的影响

2.9 玉米芯水解样品中葡萄糖和木糖含量的测定

玉米芯原料用2%稀硫酸120℃处理60 min后，大部分半纤维素水解，因此水解液中以木糖为主，存在少量的葡萄糖。而酸碱耦合处理后的酶解液中以葡萄糖为主，只有少量的木糖，因此可以用双波长法对两步水解液中的木糖及葡萄糖进行测定。经过测定，5 g绝干玉米芯原料中纤维素及半纤维素的含量分别为2.222 g、2.081 g，实验测得5 g绝干玉米芯酸水解液及酶解液中木糖和葡萄糖的含量分别为1.799 g、1.987 g，由此计算酸水解中半纤维素的水解率为86.45%，酸碱耦合处理后纤维素的酶解率为89.43%。

3 结论

采用双波长分光光度法测定玉米芯水解液中木糖和葡萄糖的含量，最佳测定条件是1 mL样品中加入5 mL显色剂，在100℃水浴加热10 min，冷却至室温，分别在波长为444 nm和420 nm下测定木糖和葡萄糖的吸光度。配置好的显色剂放置在72 h内可以用于测定，显色后在1 h内显色物质稳定。

该方法操作简单，精确度高，在实验室可以快速方便地测定溶液中葡萄糖和木糖的浓度。但是由于葡萄糖和木糖之间存在相互影响，在测定木质纤维素水解液中木糖和葡萄糖的含量时，特别是两者浓度接近时会使测定数值偏高，只有当两者浓度相差较大时才可以用于测定木质素水解液中木糖和葡萄糖的含量。

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