半乳糖凝集素3调控转化生长因子-β诱导的A549细胞上皮间质转化

王永强，刘子厚，舒 杰，汤参娥，罗凡砚

中南大学湘雅医院 1心胸外科 2医学研究中心，长沙 410008

ActaAcadMedSin，2018,40(2)：219-224

肺癌是发病率和致死率最高的恶性肿瘤，严重危害人类健康。美国癌症协会根据流行病学资料预测，2017年美国新发肺癌约222 500例，估计155 870例因为肺癌而死亡[1]。在肺癌中，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺癌浸润和转移的重要机制之一[2]，转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)是诱导肺癌发生EMT的重要细胞因子，能增强肺癌细胞的侵袭和转移能力[3]。半乳糖凝集素3是半乳糖凝集素家族中的一员，在多种肿瘤组织中高表达，参与肿瘤的发生发展，调节肿瘤进程和疾病转归[4- 5]。目前半乳糖凝集素3参与肺癌上皮间质转化研究的报道较少。本研究主要探讨半乳糖凝集素3对肺癌A549上皮间质转化的作用。

材料和方法

细胞培养人肺腺癌细胞系A549来自中南大学湘雅医院医学研究中心细胞库，使用含10%的胎牛血清和1%青霉素—链霉素的RPIM- 1640培养基培养，细胞置于37℃(5% CO2，95%空气)培养箱中生长。对照组为转染空载体腺病毒的A549，实验组包括过表达半乳糖凝集素3的A549、空载体组加入TGF-β处理和过表达组的A549加入TGF-β处理。其中TGF-β的处理浓度为20 μmol/L，加入时间为转染后48 h，处理时间为24 h。

病毒转染利用人类血清型5型腺病毒，将目的基因半乳糖凝集素3和PENTER-C-Flag载体转入肺癌A549细胞中，腺病毒载体由维真生物构建。对照组使用腺病毒空载体转染。将肺癌A549细胞种植于6孔板中，待6孔板细胞密度达到70%，加入构建好的腺病毒，每孔腺病毒数目为5×108个。培养箱中培养24 h以保证转染效率。48 h后Western blot检测转染效率。

Westernblot检测相关蛋白表达利用蛋白印记技术检测目的蛋白及EMT相关蛋白的表达水平。将干预好的A549细胞使用PBS洗涤3次，使用含有1%磷酸酶抑制剂的蛋白酶抑制剂和1%蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的强效蛋白裂解液体(碧云天生物技术，中国)提取总蛋白。蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术，中国)测定蛋白浓度。每个样本取35 μg蛋白上样，使用10%的SDS-PAGE 胶分离蛋白，将蛋白转到聚偏二乙烯膜(Millipore，IPVH00010)上，5%脱脂奶粉封闭2 h，半乳糖凝集素3(1∶1000，艾博抗公司)、钙黏附蛋白E(1∶1000，细胞信号技术公司)、波形蛋白(1∶1000，细胞信号技术公司)等一抗4℃过夜。辣根过氧化物标记的山羊抗兔二抗(1∶3000)常温孵育2 h。增强化学发光法检测。

细胞增殖实验利用细胞计数试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司，中国)检测细胞活性，绘制增殖曲线。各分组细胞干预后，以500个/孔种于96孔板，过夜培养；更换培养基，细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和培养基以1∶10加入每孔中，37℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。分别检测干预0、24、48、72、96 h的光密度(optical density，OD)值，并绘制增殖曲线。

免疫荧光检测相关蛋白表达利用抗原抗体特异结合检测细胞内相关蛋白的表达和分布。各分组细胞干预后，以103个/孔种于96孔板，过夜培养。更换培养基，继续培养48 h后PBS漂洗，4%多聚甲醛固定15 min，山羊血清封闭1 h，钙黏附蛋白E (1∶100)和 半乳糖凝集素3 (1∶200)一抗4℃过夜，cy3荧光二抗(1∶2000)室温孵育1 h，4’，6-二脒基- 2-苯基吲哚染细胞核，免疫荧光成像(PerkinElmer成像系统)。

划痕愈合实验利用机械手段检测肺癌A549细胞的迁移能力。各分组细胞干预后，以106个/孔种于6孔板，过夜培养。更换培养基，待细胞融合度达到90%，使用200 μl的移液枪吸头在6孔板中划痕，低血清连续培养48 h，显微镜下记录细胞划痕愈合距离和时间。

细胞侵袭性实验通过肺癌细胞A549消化基质胶穿过小室的细胞数目检测肿瘤细胞侵袭能力。各分组细胞干预后，以5×103个/孔种于穿透小室(康宁公司，美国)上室，上室加入含1% 胎牛血清的培养基500 μl，下室加入含10%胎牛血清培养基750 μl，继续培养48 h。去除培养基，擦除上室细胞，无水甲醇固定10 min，0.5%的结晶紫染色20 min，显微镜下观察记录穿过小室的细胞数目。

统计学处理实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0进行数据分析和统计学处理，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

半乳糖凝集素3过表达后对细胞形态和EMT相关蛋白的影响A549经过腺病毒处理后48 h，使用Western blot和免疫荧光技术检测相关基因的表达状况。与对照组相比，过表达组的A549中半乳糖凝集素3蛋白表达水平明显上升，因为腺病毒载体中加入了Flag标签蛋白，故相对分子量较大，出现双条带，达到了在A549中过表达半乳糖凝集素3的目的(图1A、1B)。免疫荧光图可见过表达半乳糖凝集素3对A549的细胞形态无影响(图1A)，半乳糖凝集素3在细胞质细胞核中均有表达。EMT相关蛋白钙黏附蛋白E和波形蛋白的表达无改变(图1B)。

半乳糖凝集素3对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响划痕愈合实验检测肿瘤细胞的迁移能力，迁移能力越强，划痕愈合面积越大。划痕愈合实验结果以其迁移面积占划痕总面积(cm2)的百分比表示，过表达半乳糖凝集素3的A549细胞与正常对照组相比，对照组为(54.8±2.6)%，过表达组为(51.0±2.7)%，差异无统计学意义(t=0.9727，P=0.3858)(图2A)。铺好基质胶的穿透小室可以用来检测肿瘤细胞的侵袭能力，穿过基质胶的细胞越多，肿瘤的侵袭能力越强。过表达半乳糖凝集素3后，相同的细胞数，对照组穿过基质胶发生侵袭的细胞数目(268±22.85)个，过表达组发生侵袭的细胞数目为(180±17.32)个，差异无统计学意义(t=0.419，P=0.6971)(图2B、2D)。CCK- 8实验可以检测细胞活性，在5 d的细胞增殖实验中，过表达后对照组和过表达组测得的OD值分别为0.41、1.01、1.35、1.25、1.39、1.45和0.48、1.01、1.27、1.18、1.42、1.47，两因素重复测量方差分析显示，差异无统计学意义(F=0.64，P=0.4322)(图2C)。

TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT时，半乳糖凝集素3对EMT相关蛋白的影响设置空载体组和空载体加TGF-β组以验证EMT的发生。空载体加TGF-β组对比空载体组，EMT相关蛋白钙黏附蛋白E表达下调和波形蛋白表达上调，TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT模型建立成功。对照组为空载体转染组加入TGF-β诱导EMT，实验组为过表达半乳糖凝集素3蛋白组加入TGF-β诱导EMT。对Western blot条带进行灰度分析和免疫荧光结果显示，与对照组相比，过表达组中半乳糖凝集素3蛋白表达水平明显上升(图3A、3B)。免疫荧光图可见发生EMT的A549的细胞拉伸变长，分散于视野中，其中实验组细胞拉伸变长的数量显著高于对照组(图3B)，EMT相关蛋白钙黏附蛋白E表达下调，波形蛋白表达上调(图3A)。

Mr：相对分子质量

Mr：relative molecular mass

A. 免疫荧光检测结果(×200)；B.Western blot检测结果

A. result of immunofluorescence(×200)；B. result of Western blot

图1A549细胞系中过表达半乳糖凝集素3后相关蛋白检测

Fig1Levels of related proteins were analyzed after Galectin3 was over-expressed

OD：光密度

OD：optical density

图2在A549细胞系中过表达半乳糖凝集素3后，细胞迁移无变化(×100)(A)，细胞侵袭性无变化(×100)(B)，细胞增殖无变化(C)，细胞侵袭性试验显示侵袭性无差异(D)

Fig2Galectin3 over-expression in A549 cell line resulted in no change in cell migration (×100) (A)，invasion (×100) (B)，or proliferation (C)，and there was no significant change in invasion detected by Transwell counting (D)

TGF-β:转化生长因子-β；aP<0.0001；bP<0.0001；cP=0.0119

TGF-β：transforming growth factor-β;aP<0.0001;bP<0.0001;cP=0.0119

A.Western blot检测蛋白表达钙黏附蛋白E降低，波形蛋白表达升高；B.免疫荧光检测实验组钙黏附蛋白E降低，向间质细胞转化数目增多(×200)

A.the expression of E-cadherin was down-regulated and the expression of vimentin was up-regulated when measured by Western blot；B. E-cadherin expression was down-regulated in experimental group，as detected by immunofluorescence (×200)，along with increased epithelial-mesenchymal transition

图3TGF-β诱导A549细胞上皮间质转化时，半乳糖凝集素3过表达的A549细胞系钙黏附蛋白E表达降低

Fig3Galectin3 promoted TGF-β-induced A549 epithelial-mesenchymal cell transformation，and E-cadherin was down-regulated in Galectin3-over-expressed A549

TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT时，半乳糖凝集素3对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响划痕愈合实验检测肿瘤细胞的迁移能力，对照组迁移面积是划痕的(44.4±3.8)%，半乳糖凝集素3过表达组迁移面积是划痕的(76.6±5.6)%，差异有统计学意义(t=4.739，P=0.0090)(图4A)。穿透小室用来检测肿瘤细胞的侵袭能力，对照组发生侵袭的细胞数目为(101±9)个，过表达组发生侵袭的细胞数目是(139±6)个，差异有统计学意义(t=5.161，P=0.0067)(图4B、4D)。CCK- 8实验检测细胞活性，对照组和过表达组测得的OD值分别为0.18、1.04、1.18、1.40、1.45和0.21、1.02、1.20、1.47、1.49，两因素重复测量方差分析显示差异无统计学意义(F=0.31，P=0.5837)(图4C)。

讨 论

肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，严重危害人类健康，其相关分子机制的研究具有重要的临床意义。半乳糖凝集素3广泛存在于各种组织和器官中，具有复杂的生物学功能，其在肿瘤的发生发展中发挥调控作用[6]。多项研究显示半乳糖凝集素3在肺癌中高表达[7- 8]，但半乳糖凝集素3调控肺癌的相关机制研究较少。因此，本研究在肺癌A549细胞系中使用腺病毒载体系统过表达半乳糖凝集素3，并检测过表达半乳糖凝集素3后A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力，结果显示过表达半乳糖凝集素3对细胞的形态功能无影响，细胞的增殖、迁移和侵袭能力无变化，EMT相关蛋白钙黏附蛋白E和波形蛋白表达无变化，表明肺癌细胞A549中高表达的半乳糖凝集素3对肺癌细胞的功能无直接影响。有研究显示半乳糖凝集素3和β-链蛋白相结合是参与肿瘤功能调解的重要机制[9]，在肺癌中，半乳糖凝集素3高表达，可以与游离的β-链蛋白相结合，使游离的β-链蛋白在细胞质内水平较低，进一步过表达半乳糖凝集素3，可能对肿瘤细胞的生物学功能无影响。

EMT是细胞失去细胞与细胞之间的黏附、极性和黏附分子并向间叶细胞的形态转变，获得间叶细胞的功能[10- 11]。EMT是肿瘤发生转移和侵袭的重要因素之一[12]。在肺癌A549细胞中，TGF-β可以诱导细胞发生EMT，促进肿瘤的迁移和侵袭[13]。由此可见，TGF-β诱导肺癌细胞发生EMT是肺癌发展的重要生物学机制之一[14]，在TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT的模型下研究半乳糖凝集素3的生物学功能很有必要。TGF-β诱导肺癌A549细胞发生EMT时，过表达半乳糖凝集素3的A549细胞向间叶细胞转化的数目和比例较对照组增多，EMT相关蛋白钙黏附蛋白E表达下调，波形蛋白表达上调，表明半乳糖凝集素3促进TGF-β诱导肺癌A549发生上皮间质转化。相应地，过表达组肿瘤细胞的迁移和侵袭能力均较对照组增强。肿瘤细胞的增殖能力未发生变化，进一步证实半乳糖凝集素3在肺癌中的作用和TGF-β作用密切相关。相关研究显示，在结肠癌、胰腺癌和壶腹周围癌转移的淋巴结中，半乳糖凝集素3表达升高，钙黏附蛋白E表达降低[15- 16]；Shimura等[17]提出钙黏附蛋白E和半乳糖凝集素3之间的调节机制，细胞表面钙黏附蛋白E减少，会使与细胞膜蛋白结合的β-链蛋白游离，游离的β-链蛋白与半乳糖凝集素3结合形成复合体，进而使肿瘤细胞迁移能力和侵袭转移能力增强。本研究明确了半乳糖凝集素3可以促进TGF-β诱导肺癌A549细胞EMT，但未能进一步揭示相关的分子机制，是细胞膜上的半乳糖凝集素3发挥作用还是细胞内的半乳糖凝集素3发挥作用，还是同时发挥作用，这些调节机制尚需进一步研究。

aP=0.0067

A.划痕愈合实验(×100)表明过表达组迁移能力加强；B.细胞侵袭性实验(×100)表明过表达组侵袭性加强；C.细胞增殖实验表明过表达组细胞增殖能力无变化；D.细胞侵袭性实验细胞计数显示过表达组侵袭性加强

A. wound healing assay (×100) suggested enhanced migration ability in over-expressed group；B. transwell assay (×100) indicated improved invasion in over-expressed group；C. cell proliferation test revealed no change in cell proliferation ability in over-expressed group；D. transwell counting suggested improved invasion in over-expressed group

图4TGF-β诱导A549细胞上皮间质转化时，半乳糖凝集素3过表达的A549细胞系细胞增殖能力无变化，细胞迁移能力和侵袭能力加强

Fig4When Galectin3 promoted TGF-β-induced A549 epithelial-mesenchymal cell transformation，the cellular migration and invasion abilities were enhanced and the proliferation ability was not changed

综上，本研究表明，半乳糖凝集素3在肺癌发生发展中发挥重要作用。半乳糖凝集素3有促进TGF-β诱导肺癌EMT的作用，可以间接增强肿瘤的迁移和侵袭能力，为肺癌的研究提供了新方向，针对半乳糖凝集素3的研究可能为肺癌的治疗提供新的线索。

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