外周血循环肿瘤细胞与非小细胞肺癌患者临床分期的相关性

胡瑞娟，吴兆红 (广州医科大学附属第三医院心胸外科，广东 广州 510150)

近年来，肺癌已成为所有癌症中发病人数最多的疾病，其死亡率和和病死率呈逐年上升趋势，已居城市恶性肿瘤之首，肺癌又可细分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，后者占据肺癌发病率的80%，其复发和转移是致使患者死亡的主要原因[1]。循环肿瘤细胞(CTCs)为自发或因诊断和治疗操作导致实体瘤或转移灶释放进入外周血液循环的肿瘤细胞[2]。我们采用免疫磁珠富集肿瘤细胞结合免疫荧光染色和荧光原位杂交的循环肿瘤细胞检测技术[3]，检测不同分期的非小细胞肺癌患者的CTCs数目，外周血循环肿瘤细胞与非小细胞肺癌患者临床分期的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年6月至2017年6月，经手术、支气管镜、纵隔镜等方式活检或者经细胞学检查确诊为非小细胞肺癌的72例患者，其中组织病理分型为：腺癌46例，鳞癌22例，腺鳞癌3例，大细胞癌1例；男性35例,女性37例；年龄41～78岁，中位年龄为61岁。临床分期根据术中、术后的病理、胸部CT、纤维支气管镜检查的结果，采用国际抗癌联盟新颁布的2017第8版肺癌的TNM分期标准分期；其中ⅠA期的病例8例，ⅠB期的10例，ⅡA期5例，ⅡB期5例，ⅢA期8例，ⅢB期5例，ⅢC期6例，ⅣA期的10例，ⅣB期15例。没有患其他恶性肿瘤或合并其他恶性肿瘤，即原发肿瘤为肺癌；也同时排除其他器官有重大疾病史、器官功能不全以及器官移植患者。该组病例CTCs检测前确定没有接受过任何抗肿瘤的治疗。同期抽取来我院体检的健康对照者28例外周血清标本。本研究方案经医院伦理委员会审议通过，所有患者都予以告知研究意义及方案并获得同意。

1.2 检测方法

采用免疫磁珠富集肿瘤细胞结合免疫荧光染色和荧光原位杂交的循环肿瘤细胞检测技术[3]。应用真空采血管采集肘正中静脉血。为防止静脉穿刺过程中上皮细胞污染，前2mL血不采集，采集此后的3.2mL静脉血于ACD抗凝管中。采集的血液在48h内去除血浆，裂解液去除红细胞，磁珠孵育混匀去除白细胞，分离液分离富集肿瘤细胞。使用CD45抗体进行细胞免疫荧光检测，用7、8号着丝粒探针进行荧光原位杂交。在荧光显微镜下计数，二倍体信号或者CD45阳性为正常细胞，大于等于三倍体且CD45阴性为异常细胞，≥2个异常细胞判断为循环肿瘤细胞阳性。

1.3 统计学分析

2 结果

经免疫磁珠阴性法富集后，利用7、8号染色体着丝粒探针标记细胞，通过杂交信号判断是否存在超二倍体细胞。72例恶性肿瘤患者中有40例出现7、8号染色体拷贝数增多，即超二倍体细胞(阳性率为55.56%)。而健康组的阳性率为0%。

循环肿瘤细胞阳性率为55.56%(40/72)，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的阳性率分别是33.3%、60.0%、57.9%、68.0%，阳性病例：ⅠA期3例(3/8)，ⅠB期3例(3/10)，ⅡA期3例(3/5)，ⅡB期3例(3/5)，ⅢA期5例(5/8)，ⅢB期3例(5/8)，ⅢC期3例(3/6)，ⅣA期6例(6/10)，ⅣB期11例(11/15)。表现为阴性32例(假阴性率44.44%)：ⅠA期5例，ⅠB期7例，ⅡA期2例，ⅡB期2例，ⅢA期3例，ⅢB期2例，ⅢC期3例，ⅣA期4例，ⅣB期4例。循环肿瘤细胞阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。此外，Ⅲ期和Ⅳ期CTCs达到5以上的患者人数明显高于Ⅰ期和Ⅱ期，见表1。

表1 循环肿瘤细胞阳性率与非小细胞肺癌临床分期的关系

3 讨论

在本研究中，非小细胞肺癌患者的循环肿瘤细胞的检测总阳性率为55.56%，而同期非恶性肿瘤患者中循环肿瘤细胞的检测率为0%，这说明本研究使用的循环肿瘤细胞的检测方法有较好的特异性。本研究使用的方法是使用磁珠富集肿瘤细胞，并结合了免疫荧光染色和荧光原位杂交两种技术，不受上皮标志物表达所限，可提高循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性[4]。

临床分期是评价非小细胞肺癌的基本方法。本研究发现，在ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅢA、ⅢB、ⅢC、ⅣA、ⅣB期CTCs阳性率分别为37.5%、30.0%、60.0%、60.0%、62.5%、60.0%、50.0%、60.0%、73.3%。说明CTCs阳性率及数目可以成为临床分期的一个重要指标和佐证。

由于循环肿瘤细胞是肿瘤细胞脱落进入血液系统的，故极易随着血流进入身体其他器官，导致肿瘤转移[5,6]。有研究在非小细胞肺癌患者中发现，CTCs可以早期预测肿瘤的转移[7]，本研究入组病例数少、特别是早期病例不多，还需要进一步研究证实。此外，还有研究结果发现非小细胞肺癌患者外周血中存在的CTCs与患者的疗效及预后有极大相关性，当CTCs≥5时，预后更差[8]。

综上所述，CTCs检测的阳性率与非小细胞肺癌的临床不同分期呈正相关性，可用于NSCLC的病情监测、疗效评估及预测预后。但循环肿瘤细胞的检测中仍存在假阴性，对于非小细胞肺癌的临床意义还有待进一步的验证。

[参考文献]

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[8] 冯也倩.循环肿瘤细胞计数在非小细胞肺癌患者的临床应用研究[D].长沙：中南大学,2009.DOI:10.7666/d.y1535990.