Notch/Dll4通路在卵巢癌中的表达及临床意义

李占巍， 郑洁， 刘雯

卵巢癌起病隐匿，75%～80%的卵巢癌患者确诊时已发生转移[1]。恶性肿瘤的无限制细胞增殖特性导致其对能量的需求是普通细胞的若干倍，相应的需要完善的供氧、供血体系。血管的发生、成熟程度对肿瘤的生长、转移的重要性不言而喻。研究发现，Notch1a分子与其配体Dll4结合形成转录复合物，在正常机体及肿瘤血管的发生、血管腔形成的过程中发挥重要功能[2]。本研究采用实时荧光定量PCR等方法检测Notch1a、Dll4在卵巢癌及正常卵巢组织中的表达情况并观察其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年6月至2017年6月辽阳市第五人民医院术前未经治疗行卵巢切除且病理证实为卵巢癌的39例患者为研究对象(观察组)，另选择同期基线水平相似经手术切除且病理证实为卵巢良性疾病的28例患者为对照(对照组)。观察组平均年龄61.28(36～75)岁；病理类型：浆液性腺癌19例，黏液性腺癌10例，内膜样腺癌8例，其他类型2例；组织学分级：低分化12例、中分化17例、高分化10例；国际妇产科联合会FIGO分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期22例，Ⅳ期8例。对照组平均年龄60.79(38～72)岁；诊断：卵巢浆液性囊腺瘤16例，黏液性囊腺瘤8例，卵巢平滑肌瘤3例，纤维上皮瘤1例。本研究通过辽阳市第五人民医院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂及仪器 标本采集后，立即置入液氮冷冻，然后转入-70 ℃冰箱备用。总RNA抽提试剂盒Trizol(批号：15596-026，美国Invitrogen公司)；RNAiso Plus Kit提取试剂盒[批号：BK3303，宝生物工程(大连)有限公司]；Primescript RT Reagent Kit试剂盒[批号：BK503，宝生物工程(大连)有限公司)]；SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒[批号：BK402，宝生物工程(大连)有限公司]；实时荧光定量仪(德国Juipiter仪器设备有限公司)。

1.3 研究方法 采用Trizol试剂盒提取卵巢癌组织以及正常卵巢组织总RNA，反转录合成单链cDNA第一链，按试剂盒操作说明书制备实时荧光定量PCR，采用倍性变化方法对实时荧光定量PCR数据结果进行分析。本实验中所需用的基因引物及内参照引物的基因序列均来自美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库，运用QIUKE GENE设计软件进行设计筛选而成。Notch1正向引物序列： 5’-GCCGCAGATGCAGGGCAATGAAGT-3’；反向引物序列：5’-GAGGGCAGGCAGGGCTGGTAGAGG-3’。 Dll4正向引物序列：5’-AGGCCTGGCACTCACCTTACTC-3’；反向引物序列： 5’-CACCCCAGCCCTCTTTACAGTT-3’。PCR反应条件如下：95 ℃，30 s，预变性40个循环；95 ℃，5 s，变性；55 ℃，30 s，退火；72 ℃，30 s，充分延伸，采集荧光。β肌动蛋白为内参照。

1.4 统计学方法 运用depression software 2.1软件进行计算，计算方法为：△CT(递增倍数)=目的基因Ct-内参基因Ct；△△CT=△CT(实验组)-△Ct(对照组)；mRNA表达差异倍数=2-△△CT，其中正常组织对照组数值均为1。利用SPSS 18.0软件进行统计分析，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Notch1a基因的测定 Notch1a基因与β肌动蛋白引物所扩增的基因片段经比对，扩增曲线形态光滑，整体平行好。融解曲线只有一个单峰，平行组间峰度重合良好，扩增产物单一，特异性良好，可重复，数据可靠。见图1。

图1 Notch1a基因基因荧光定量PCR扩增曲线和融解曲线1A：Notch1a基因荧光定量PCR的扩增曲线，该扩增曲线斜率一致；1B：Notch1a基因荧光定量PCR的融解曲线，该溶解曲线为单一尖锐的峰

2.2 Dll4基因的测定 Dll4基因与β肌动蛋白引物所扩增的基因片段经比照，扩增曲线形态光滑，整体平行好。融解曲线只有一个单峰，平行组间峰度重合良好，扩增产物单一，特异性良好，可重复，数据可靠。见图2。

图2 Dll4基因荧光定量PCR扩增曲线和融解曲线2A：Dll4基因荧光定量PCR的扩增曲线，该扩增曲线斜率一致；2B：Dll4基因荧光定量PCR的融解曲线，该溶解曲线为单一尖锐的峰

2.3 Notch1a、Dll4在卵巢癌组和对照组表达的比较 Notch1a在卵巢癌组织与正常卵巢组织中mRNA表达差异倍数2-△△CT=2.55，差异有统计学意义(P<0.05)。Dll4在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的mRNA表达差异倍数2-△△CT=1.32，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 定量检测Notch1a/Dll4在正常卵巢组织和卵巢癌组织的表达

3 讨论

肿瘤血管的生成是肿瘤细胞和组织在一定的信号刺激下释放多种、多功能的生成刺激因子，使血管内皮细胞裂变、增殖、迁移。血管细胞是无序生长，需要相关骨架的支持，所以细胞外基质重塑对血管内皮细胞的生长起调控作用，血管内皮细胞首先形成新芽，在调控机制下微血管形成，最后动静脉分化。

Notch基因于1919年被首次发现，直到20世纪80年代中期，Artavanis Tsakona团队才首次通过克隆获取了该基因[3]。它编码一种2753个氨基酸残基组成的300 kD跨膜蛋白膜受体，包括33～36个随机表皮生长因子样重复序列和3个富含半胱氨酸的重复区组成的胞外段[4]以及由RAM结构区、6个细胞分裂周期基因10重复区、2个核定位信号、OPA谷氨酸胺丰富区和富含PEST序列区域5部分共同组成的胞内区[5]。Notch1a基因可促进血管生成，Notch1a功能丧失会引起血管重塑障碍，甚至引起严重的畸形[6]。近年来研究表明，尖端细胞/柄细胞在出芽生长过程中往往互相更换自己所起的作用，展示顶端细胞和基底细胞显型始终是一种在不断变化的、非稳定的细胞形状和结构[7]。Notch1a信号可调控尖端细胞/柄细胞分化的动态性与稳定性。通过开始建立血管网络，内皮细胞达到静止状态以阻断多余的血管尖端细胞形成。柄细胞中表达的Notch1a调节锚蛋白抗体能够调节Notch1a信号通路，监管刚形成的血管连接的确定性，敲除小鼠Notch1a调节锚蛋白抗体能够导致血管网的衰退[8]。

Dll4是Notch通路配体其中之一，但是Dll4分子是最迟一个被复制的基因[9]。当配体Dll4与Notch受体相结合，进一步激活Notch受体，活化Notch信号通路。 Dll4/Notch信号通路不仅可以调控正常的血管发生、成熟以及接触抑制，同时对于病理情况下血管异常增殖也能起到控制，但作用机制不全相同，在正常机体基本以促进血管为主要方面，而在肿瘤组织则抑制血管内皮增殖及成熟分化[10]，表明Notch/Dll4信号通路在卵巢癌的发生过程中可能起癌基因作用[11]。有研究显示，Notch1a 和Dll4信号在卵巢癌患者腹水中有表达[12]。

本研究中卵巢癌组织中Notch1a 和Dll4基因表达水平均较正常卵巢组织增高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示可将Notch1a 和Dll4作为卵巢癌诊断的一个参考指标，亦可将Notch/Dll4通路作为针对卵巢癌治疗的靶标，即通过抑制Notch/Dll4的过表达从而抑制卵巢癌组织的血管生成，控制肿瘤的恶性增长。

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