化浊通脉方防治兔动脉粥样硬化及对脂质代谢影响的实验研究

王冰艳，王文慧，张艳虹，徐凤芹

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种在动脉内膜沉积过多脂质的慢性炎症性疾病[1]，脂质代谢异常是其主要危险因素。大量基础和临床研究表明，通过调节脂质代谢异常可减缓AS发生发展。欧洲心脏病学会与动脉硬化学会亦指出，调脂应贯穿于心脑血管病防治过程始终[2]。AS作用机制及防治策略是近年来心血管领域研究的热点和难点。中医认为AS属于“脉浊”病的范畴[3]，血浊阻滞脉络为其病机特点。已有研究证实，化浊通脉类的中药单体和复方通过调脂、抗炎等作用发挥防治AS的作用，在临床上展示出良好的应用前景[4-6]。本研究旨在通过构建新西兰大耳兔AS模型，应用不同剂量化浊通脉方干预，初步探讨其防治AS的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新西兰大耳白兔60只，雄性，(8～12)周龄，由北京芳园养殖有限责任公司繁殖饲养，实验动物合格证号：SCXK(京)2014-0012，实验前经7 d普通饲料适应性喂养。

1.2 药物及饲料 化浊通脉方：药物组成为虎杖、荷叶、山楂等六味中药，委托中国中医科学院西苑医院制剂室生产，批号：20150802。辛伐他汀片(商品名：舒降之)，每片20 mg，由杭州默沙东公司生产，批号K014576。普通饲料和高脂饲料均由北京华阜康生物科技股份有限公司生产，生产批号SCXK(京)2014-0010。其中高脂饲料配方：1%胆固醇，15%蛋黄粉，1%猪油，83%普通饲料。

1.3 实验仪器 全自动生化分析仪：日本HITACHI(7600-020型)，离心机：美国SIGMA(3K15型)，显微镜：日本OLYMPUS BX51T-PHD-111(日本Nikon E200)，切片机：德国Leica RM2016。

1.4 模型制备与分组 应用高脂饲料喂养法建立新西兰兔AS模型[7-8]，采用随机数字表法将60只新西兰大耳白兔随机分为5组，每组12只，即对照组、模型组、化浊通脉方小剂量(HZTML)组、化浊通脉方大剂量(HZTMH)组和辛伐他汀(Sm)组。对照组：予普通饲料喂养22周；模型组：予高脂饲料喂养14周，普通饲料喂养8周；Sm组、HZTML组和HZTMH组分别给予高脂含药饲料喂养14周，后8周喂养普通含药饲料，其中Sm组饲料含辛伐他汀2 mg/(kg·d)，HZTML组饲料含化浊通脉方6.5 g/(kg·d)，HZTMH组饲料含化浊通脉方13 g/(kg·d)。其中，HZTML组每日给药剂量等同于成人每日临床推荐常用剂量，HZTMH组每日给药剂量等同于HZTML组的2倍。

1.5 取材及指标检测

1.5.1 组织病理学检测 第22周末当日以空气栓塞法处死兔，取出胸主动脉至腹主动脉分叉处上端组织，从中间剖开置于预冷培养皿上展平拍摄大体样本，观察主动脉脂纹脂斑形成。按顺序分解主动脉管壁，取胸主动脉分叉处置于中性甲醛固定后进行HE染色观察。

1.5.2 血脂水平测定 分别于实验前、实验14周末当日及22周末当日空腹禁食8 h后，经耳缘静脉采血5 mL置于抗凝管中，离心，取上清液置于-80 ℃冰箱中备用。应用酶联免疫吸附法测定总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇( HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白A1(ApoA1)水平。

2 结 果

2.1 动物一般情况 各组实验动物均存在不同程度的饮食量减少、腹泻等症状，以实验前期最频繁、严重。至第22周末，共死亡15只，分别是对照组2只、模型组4只、HZTML组2只、HZTMH组4只、Sm组3只。

2.2 形态学观察 22周后各组兔胸主动脉管壁肉眼观察，对照组管壁光滑，无脂质沉积；模型组管壁明显脂质条纹形成，斑块满布，提示AS兔模型制备成功；Sm组及HZTMH组管壁也可见散在斑块形成，但范围较小；HZTML组管壁可见明显斑块，但较模型组范围小。表明大剂量化浊通脉方能抑制兔AS斑块的形成并减轻硬化程度(见图1)。

1为对照组；2为模型组；3为Sm组；4为HZTML组；5为HZTMH组。

22周后各组胸主动脉分叉处石蜡切片经HE染色后在光学显微镜下观察，对照组平滑肌细胞排列整齐、紧密有序，内皮细胞层连续，内皮下无脂质沉积，各层结构清晰；模型组内皮不连续，内膜增生严重，管壁内满布斑块，可见大量泡沫细胞，中外膜不规则增厚，可见泡沫细胞浸润； HZTMH组及Sm组均可见内皮细胞连续，内膜下见脂质沉积，见散在薄斑块，未见明显泡沫细胞沉积，中外膜与对照组厚度相当，较模型组薄；HZTML组可见内膜不连续，部分隆起，中外膜增厚，少量泡沫细胞浸润。详见图2。提示：大剂量化浊通脉方能减少泡沫细胞在内膜下堆积，减轻血管壁脂质沉积，抑制血管平滑肌细胞增殖重构，且作用与辛伐他汀相似。

1为对照组；2为模型组；3为Sm组；4为HZTML组；5为HZTMH组。箭头所示为动脉管壁斑块，其长度与斑块厚度相关。

2.3 血脂水平检测 给药14周，与对照组比较，模型组TC、TG、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，各给药组TC、LDL-C、ApoB水平降低(P<0.05)，HDL-C、ApoA1水平升高，并对TG、VLDL-C水平有不同程度调节，但差异均无统计学意义(P>0.05)；与Sm组比较，HZTML组与HZTMH组TC、TG水平均降低并对LDL-C、VLDL-C、ApoB、 HDL-C、ApoA1水平均有不同程度调节，但差异无统计学意义(P>0.05)。表明化浊通脉方大、小剂量组均能不同程度调节血脂水平，且与辛伐他汀作用相似。详见表1。

给药22周，与对照组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均升高(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平亦升高，但差异均无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，各给药组血清TC、LDL-C、VLDL-C、ApoB水平均降低(P<0.05或P<0.01)，TG和HDL-C水平亦降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，ApoA1水平均不同程度升高，以辛伐他汀组显著(P<0.05)；与Sm组比较，HZTML组与HZTMH组对TG、TC、ApoB、LDL-C、 VLDL-C、HDL-C、ApoA1水平均有不同程度调节，但差异无统计学意义(P>0.05)。化浊通脉方大、小剂量均能不同程度调节血脂水平，且与辛伐他汀作用相似。详见表2。

表1 各组14周末AS兔血脂等指标水平的影响(±s)

表2 各组22周末AS兔血脂等指标水平的影响(±s)

3 讨 论

现代研究表明，AS是冠心病和脑血管疾病发生发展过程中的始动环节[9]。其中，血脂异常是AS发生的主要危险因素[10]。大量研究表明，TC、TG和 LDL-C可促进AS的发生发展，而HDL-C对其具有延缓作用[11]。积极降低TC、TG，尤其是LDL-C水平，可延缓AS斑块进展，防止血栓形成，甚至促进斑块消退[12]。

化浊通脉方由虎杖、草决明、郁金等6味中药组成，是中国中医科学院西苑医院徐凤芹教授结合多年临床经验，根据AS病人以浊、痰、瘀、毒为主要病机特点总结而成。方中虎杖清湿热、散瘀毒，为君药，草决明润肠通便、分利浊邪为臣药，郁金行气通脉为佐使之药等。全方以化浊祛湿通络为纲，佐以行气、清化脂浊之药，共奏化浊祛湿、散瘀通脉之功，广泛应用于冠心病、血脂代谢异常病人的防治。目前课题组纳入高脂血症合并颈动脉斑块形成病人，通过血脂水平检测和颈部血管超声观察，发现其具有降脂和消斑的作用。基于此，本研究通过构建新西兰大耳兔AS模型，给予不同剂量化浊通脉方干预22周后进行胸主动脉大体形态和HE染色观察以及血脂水平检测，初步探讨该方防治AS的可能机制，为进一步研究提供实验基础。

大量临床研究证实，血清TC、TG和LDL-C水平与AS风险呈正相关。其中，LDL-C经氧化修饰后，可穿过受损的平滑肌细胞间隙，渗入到内膜下，在巨噬细胞内大量蓄积，进而形成泡沫细胞[13]，最终促进AS的发生发展。因此，调节脂质代谢，减少脂质沉积对抑制AS的发生发展具有重要意义。正常的VLDL-C没有直接致AS的作用，但是VLDL-C代谢后产生的LDL-C具有致AS作用。血清ApoB主要反映LDL-C水平，它与血清LDL-C水平呈明显正相关，有研究表明其更能作为冠心病的预测指标[14]。ApoA1是HDL-C的蛋白组成成分，占据HDL-C 65%～70%的蛋白含量[15-16]，是细胞外胆固醇的主要受体。ApoA1对于HDL-C功能的实现具有重要意义。亦有研究表明，HDL-C功能的实现应关注其结构组成，而不是水平[17]。HDL-C功能较HDL-C水平能更好地预测动脉粥样硬化及冠心病发病风险[18]。

本实验采用前14周给予高脂饲料喂养造模的同时进行药物干预，后8周改为普通饲料喂养，同时进行药物干预，观察药物预防AS的同时，探讨其在斑块形成过程和对已有斑块的治疗作用。与一般斑块消退实验不同，一方面延长药物作用时间，实验开始即给药，而不是造模成功后再给药，更好地体现中药的预防作用；另一方面，并未在造模成功后立即处死模型动物，而是让模型组也经历消退期，以避免高脂饲料对药物抗AS作用的干扰。通过胸主动脉大体形态和HE染色病理形态学观察，发现造模22周后模型组动脉管壁可见明显脂质条纹形成，斑块布满整个管壁，并有泡沫细胞浸润；各药物干预组可不同程度抑制动脉粥样硬化斑块形成，抑制血管平滑肌细胞增殖重构，以大剂量化浊通脉方组和辛伐他汀组作用显著。对其防治AS作用机制进行了初步探讨。给药14周和22周，模型组血清TC、TG、LDL-C、VLDL-C、ApoA1、ApoB水平均较对照组显著升高；给予大、小剂量化浊通脉方干预后血脂水平均有不同程度改善，且与辛伐他汀作用相似。其中，应用化浊通脉方对血清HDL-C水平的调节作用不明显，差异无统计学意义，推测是否与其调节HDL-C亚型分布有关，尚需进一步检测血浆HDL-C颗粒亚型加以验证。

化浊通脉方可通过调节模型兔血脂代谢紊乱达到防治AS的作用，具体作用机制有待进一步研究。

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