不同脱除剂对暂养紫贻贝体内重金属Cd2+的脱除效果

房传栋,张 宾,吕丹丹,章样扬,郝桂娟

(浙江海洋大学 浙江省海产品健康危害因素关键技术研究重点实验室,浙江舟山 316022)

紫贻贝(Mytilusedulis),俗称淡菜、海虹,具有味道鲜美、营养丰富等特点,因而深受国内外消费者欢迎。我国作为贻贝类产品主要生产和贸易大国,总产量连续多年居世界前列。紫贻贝属滤食性生物、移动性差,养殖基地大多在污染较重的近海区域,因此其在滤食铒料的同时,也大量富集了海水中重金属、化学污染物等有害物质[1]。

对于贝类体内重金属(如Cd2+)、致病微生物等有害物质,可通过净水暂养或净化方式得以部分脱除,但其缺点是周期长、损耗大,且会污染暂养区水质[2]。许梓荣等[3]采用纳米蒙脱石、氯化钠和壳聚糖作为饲料添加剂,通过物理吸附可减轻Cd2+对贝、鱼类毒害作用,但其饲料配比复杂、吸附脱除作用有限。孙继鹏等[4]制备的水溶性壳寡糖-金属配合物,可置换贝体内MT-Cd2+中的Cd2+离子,对栉孔扇贝Cd2+具有一定脱除作用。程珊珊[5]用壳聚糖、N,O-羧甲基壳聚糖处理急性染Cd2+牡蛎,发现二者均可降低牡蛎体内Cd2+含量,且N,O-羧甲基壳聚糖处理效果较佳。关于人体内重金属的脱除,主要是服用解毒剂,如环己烷二胺四乙酸、2,3-二巯基丙醇、二巯丁二酸等,其原理是靠其含有的巯基、氨基或羧基等争夺与MT结合的重金属离子,形成不溶性复合物而排出体外,但其脱除效果较为有限。目前,关于贻贝类水产动物体内重金属安全脱除技术研究还较少,寻找有效降低紫贻贝体内Cd2+的新方法对我国贝类水产品安全具有重要意义。本文通过比较不同脱除剂对暂养紫贻贝体内重金属Cd2+的影响,旨在寻找一种有效的紫贻贝体内Cd2+脱除剂及探索其应用方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫贻贝 购于舟山市东河菜场；壳长(9.0±0.5) cm,壳宽(4.0±0.3) cm,壳高(7.0±0.4) cm,质量(56.0±3.4) g,暂养水体取自舟山附近海域海水,经沉淀、砂滤处理后进行养殖紫贻贝，经检测分析,海水本底Cd2+<0.04 μg/L,pH7.8～8.0,盐度29‰～31‰。氯化镉、乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA-CaNa2) 上海沃凯化学试剂有限公司;β-葡聚糖 日本和光纯药工业株式会社;肽聚糖 郑州欧科拜克生物技术有限公司;L-硒代蛋氨酸 江南化学试剂有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸铁钠(EDTA-FeNa)、乙二胺四乙酸锌钠(EDTA-ZnNa)、亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司;硒化卡拉胶(DP 2～20,κ型) 上海甄准试剂有限公司;氯化铁、氯化亚铁、高氯酸、硝酸等 国药化学试剂有限公司。实验所用试剂 均为分析纯。

Direct-Q3U型超纯水制备机 法国Millipore公司;MDF-U53V型超低温冰箱 日本SANYO公司;Tube Mill 100 control型研磨机 IKA集团;SH230N型重金属消解仪 济南海能仪器股份有限公司;AA-7000型原子吸收分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫贻贝暂养 将紫贻贝清除附着物后,置于直径100 cm、高60 cm圆柱形聚乙烯暂养箱中。每箱添加海水40 L,紫贻贝暂养7 d。为避免残饵及粪便影响,暂养及实验期间不投喂饵料。暂养期间隔日更换新鲜海水,每次换水量为总体积的3/4,24 h持续通氧,定期剔除死亡及活力不强的紫贻贝个体。

1.2.2 紫贻贝Cd2+染毒 紫贻贝经7 d暂养稳定后,挑选活力较强、大小均一个体随机放入养殖箱(30只/箱)。添加40 L含0.40 mg/L CdCl2养殖海水,持续通氧,隔日换0.40 mg/L CdCl2养殖海水3/4。Cd2+暴露染毒为期7 d,每天定期剔除死亡及活力不强个体。

1.2.3 紫贻贝Cd2+脱除 选取Cd2+染毒7 d后紫贻贝作为样品,随机进行分组,每箱加水40 L含有以下不同脱除剂的海水,每3 d取样1次。取样时更换相应的含有脱除剂的海水,持续通氧。每组取样4只紫贻贝,用超纯水冲洗干净,解剖后备测。

实验分组:空白组:清洁海水;硒化物组:20和40 mg/L硒代蛋氨酸、60和120 mg/L硒化卡拉胶、1和2 mg/L亚硒酸钠;络合剂组:80和160 mg/L EDTA、220和440 mg/L EDTA-FeNa、280和560 mg/L EDTA-ZnNa2、80和160 mg/L EDTA-CaNa2;金属盐组:120和240 mg/L FeCl2、160和320 mg/L FeCl3、80和160 mg/L ZnCl2;糖类组:250和500 mg/Lβ-葡聚糖、100和200 mg/L肽聚糖、80和160 mg/L葡萄糖酸钙。

1.3 实验测定与分析

1.3.1 Cd2+含量测定 将紫贻贝肉整体进行8000 r/min匀浆2 min后,称取0.800～1.200 g,加入HNO312.0 mL、HClO43.0 mL,混匀后消解。消解程序:升温至100 ℃,保持30 min;至130 ℃,保持60 min;再升温至150 ℃,至消解完成;最后升温至180 ℃,赶酸至样品容量约2 mL。冷却至室温,超纯水定容50 mL,应用岛津AA-7000型原子吸收分光光度计测定吸光度,代入标准曲线(y=0.27816x+0.08227,R2=0.9995)计算获得Cd2+含量(湿重,μg/g)[6]。

1.3.2 脱除率计算 Cd2+脱除率(%)=[脱除前Cd2+含量(μg/g)-脱除后Cd2+含量(μg/g)]/脱除前Cd2+含量(μg/g)×100

1.4 数据分析与统计

以上实验及分析测定,至少3个平行样品,计算平均值。数据分析与统计采用SPSS 13.0分析软件,结果为平均值±标准差。

2 结果与讨论

2.1 不同硒化物对紫贻贝体内Cd2+含量的影响

硒元素(Se4+)在生物体内具有抗氧化、免疫调节等多种生物学活性,是生物体内重金属元素的良好拮抗剂,能有效拮抗重金属元素在体内的积累[7]。但Se4+元素对机体的致毒浓度较低,如小鼠的亚硒酸钠LD50为3.86 mg/kg(经口),其安全限度空间较狭窄[8]。本研究比较了三种含硒化合物及其不同浓度对染毒紫贻贝体内Cd2+含量的影响,结果见表1。经过12 d净化处理后,60 mg/L和120 mg/L硒化卡拉胶,表现出了显著Cd2+的脱除效果(p<0.05),脱除率分别为43.6%和37.2%。此外,硒化卡拉胶对紫贻贝体内Cd2+的脱除,均主要集中在0～6 d,第6 d的脱除率已达到37.9%和31.1%。此外,由于含Se4+化合物在生物体内安全浓度范围较狭窄,过多Se4+则可能会对机体产生毒性。

表1 不同硒化物对紫贻贝体内Cd2+含量的影响Table 1 Effect of different selenide on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

目前,关于Se4+拮抗Cd2+毒性作用机理未完全清楚,存在以下几方面推理:Se4+的抗氧化作用;Se4+能清除Cd2+引发的氧自由基;体内形成Se4+-Cd2+复合物;Se4+诱导体内MT(金属结合蛋白)的合成。Se4+及其化合物(如硒化氨基酸、硒化多糖)在机体内具有显著的清除自由基,并提高相关内源保护酶活性等[9],并已在多种水产动物体内得以证实,如罗非鱼[10]、凡纳滨对虾[11]等。而本实验中,亚硒酸钠、硒代蛋氨酸处理,对紫贻贝体内Cd2+未表现出显著的脱除作用(p>0.05)。可以推断,Se4+可能通过抗氧化机制,在紫贻贝体内发生Cd2+的拮抗或抵御摄入作用,但在本批次实验中未能使Cd2+有效的排出体外;此外,可以得出与Se4+结合的配体类型对Cd2+的脱除也具有重要的影响。研究表明,相比于亚硒酸钠和硒代蛋氨酸,硒化卡拉胶(κ型)对实验兔的体液免疫功能及抗氧化能力的提高作用显著[12],其可为拮抗Cd2+毒性提供良好的体内环境;与Se4+结合的配体类型也可影响对Cd2+的脱除作用。此外,卡拉胶低聚糖具有较好的化学稳定性、聚集重金属离子、免疫调节、降血脂等多种生物功能[13]。因此,本实验中硒化卡拉胶表现出较好的Cd2+脱除作用,其原因可能来自多方面的协同效应,如Se4+的体内抗氧化作用、卡拉胶低聚糖作为载体携带Se4+进入机体而被吸收、卡拉胶低聚糖鳌合Cd2+及其免疫调节作用等方面的综合作用。

2.2 不同金属络合剂对紫贻贝体内Cd2+含量的影响

EDTA是一种广谱的金属元素络合剂,常用于改善水生生物培养及育苗水体的水质质量[14]。部分研究指出,EDTA对水产品体内重金属脱除具有一定的作用。EDTA及其金属化合物种类较多,本研究比较了常见EDTA类络合物对紫贻贝体内Cd2+含量的影响(表2)。结果表明,净化12 d后,EDTA和EDTA-CaNa2对紫贻贝体内Cd2+脱除效果显著(p<0.05),二者低浓度组脱除率为30.4%和21.3%,高浓度脱除率分别为24.6%和41.6%。实验中,较低浓度EDTA对紫贻贝体内Cd2+净化效果较好,其原因可能是由于EDTA浓度过高时,螯合了紫贻贝体内大量生长所需的必需金属离子,而使紫贻贝生理活力降低、Cd2+脱出量较少。此外,160 mg/L EDTA-CaNa2净化效果最佳,其Cd2+脱除率显著高于其他各组(p<0.05)。在整个净化实验期内,EDTA-FeNa和EDTA-ZnNa2未表现出显著Cd2+脱出效果(p>0.05)。

表2 不同EDTA络合剂对紫贻贝体内Cd2+含量的影响Table 2 Effect of different EDTA compounds on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

目前,在临床上我国使用小剂量EDTA-CaNa2作为儿童铅中毒的治疗方案[15],还有应用EDTA对尿镉超标者进行驱镉效果的研究报道[16]。Hiraoka等[17]在人工海水中添加0.5% EDTA(w/v),48 h后发现EDTA可有效脱除暂养牡蛎体内的Cd2+和Cu2+含量。但Das等[18]报道了相反的结果,发现添加EDTA对贝类Cd2+含量无显著影响。本实验结果更加倾向于Hiraoka等报道结果,其原因可能主要来自于EDTA的金属元素络合作用。此外,另有研究表明,双壳贝类中Cd2+通过Ca2+通道吸收并转运,在暂养水体中添加Ca2+以竞争Ca2+通道,或者添加Ca2+通道抑制剂,均可显著抑制Cd2+的富集,加速其排出[19]。

本研究中,EDTA-CaNa2表现出较好的Cd2+净化效果,而EDTA-FeNa、EDTA-ZnNa2无显著性效果,其部分原因可能来自于Ca2+在紫贻贝体内的竞争性作用。但仍需要指出的是,EDTA络合物具有较强的金属元素络合作用,其对紫贻贝体内其他金属元素含量的影响及安全性评价,还需进一步研究探讨。

2.3 不同金属盐对紫贻贝体内Cd2+含量的影响

本部分实验尝试利用低毒性铁、锌化合物处理暂养紫贻贝,以期评价其对紫贻贝体内重金属含量的影响。结果见表3，由表可知,FeCl2、FeCl3及低浓度的ZnCl2对紫贻贝体内Cd2+均未表现出显著的净化脱除效果;仅当ZnCl2浓度较高时(160 mg/L),经12 d净化期后,紫贻贝体内Cd2+脱除率为17.6%,其脱除效果主要表现在6～12 d,净化处理时间相对较长。锌元素(Zn2+)作为生物体的必需元素,是维持机体诸多蛋白质正常结构和生物功能的重要组成部分。在水环境中,Zn2+和Cd2+往往是共存的,由于Zn2+和Cd2+化学性质相似,因此二者之间易于产生相互作用。柴茜等[20]研究发现,在一定条件下,Zn2+对Cd2+引起的河南华溪蟹的氧化损伤作用,具有明显的抑制作用;Zn2+对机体的保护作用与其促进抗氧化酶SOD、CAT的合成有关,并通过诱导MT的合成来实现;对于生物活性部分中的Cd2+,较高浓度Zn2+能促进Cd2+的有效排出。本研究结果,与柴茜等报道结果相一致。

表3 不同金属盐对紫贻贝体内Cd2+含量的影响Table 3 Effect of different metal compounds on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

2.4 不同糖类物质对紫贻贝体内Cd2+含量的影响

β-葡聚糖、肽聚糖等作为常见的水产养殖动物免疫增强剂,已证实其对鱼类、虾类等[21-22]具有显著的提高生长性能、存活及增强机体免疫力等活性。本部分研究,探索不同糖类物质对紫贻贝体内Cd2+含量的影响,如表4所示。结果表明,500 mg/Lβ-葡聚糖、80 mg/L和160 mg/L葡萄糖酸钙对Cd2+净化效果显著(p<0.05),Cd2+脱除率依次为44.6%,17.2%和28.0%,且在0～6 d净化期内脱除效果较好,而随着脱除时间延长,紫贻贝体内Cd2+含量基本保持平稳。本实验中,肽聚糖对紫贻贝体内Cd2+净化脱除无明显效果。

表4 不同糖类物质对紫贻贝体内Cd2+含量的影响Table 4 Effect of different saccharides on the content of Cd2+ in Mytilus edulis

β-葡聚糖由β-1,3-D-吡喃型葡萄糖聚合而成,具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等多种生物功能[23],其功能机制主要是以激活免疫细胞,促进抗体的产生为主,从而调节机体的免疫机能[24]。本实验中,β-葡聚糖对紫贻贝表现出较好的Cd2+净化效果,但其应用剂量较大;也有研究指出,β-葡聚糖还存在着免疫调节时间短、会出现“免疫疲劳”等问题[25],因此,单独的β-葡聚糖进行水产动物Cd2+净化,应用成本较高,不适合推广应用。另一方面,葡萄糖酸钙作为一种营养强化剂,已用于多种人体排铅口服液中的主要成分,起到一定的重金属排出效果。朱连勤等[26]向小鼠染毒饲料中添加葡萄糖酸钙,评价了葡萄糖酸钙对小鼠铅中毒的影响作用,结果显示葡萄糖酸钙可提高小鼠抗氧化酶活性、显著降低了铅对机体的毒性作用。本研究结果符合以上文献报道及应用效果。此外,由于葡萄糖酸所携带的Ca2+对紫贻贝机体内Cd2+的净化排出,也可能起到一定的积极作用。

3 结论

净水暂养法脱除贝类体内的重金属,存在周期长、损耗大且会再次污染暂养水域等弊端,因此探索不同的贝类重金属脱除方法,对保障贝类食品安全具有重要意义。本研究比较了不同的硒类化合物、EDTA类络合物、金属盐类及糖类物质等对紫贻贝体内Cd2+含量影响情况,结果发现,经过12 d的脱除,60和120 mg/L硒化卡拉胶、80和160 mg/L EDTA及EDTA-CaNa2、160 mg/L氯化锌、500 mg/Lβ-葡聚糖、80和160 mg/L葡萄糖酸钙净化处理,对紫贻贝体内Cd2+具有显著脱除效果,其脱除率分别为43.6%、37.2%、30.4%、24.6%、21.3%、41.6%、17.6%、44.6%、17.2%和28.0%,其中,脱除效果最优的为500 mg/Lβ-葡聚糖,其脱除率为44.6%。但紫贻贝体内Cd2+净化机制仍需进一步探讨。研究内容将为今后继续研究脱除水产动物中重金属残留,开发具有脱除重金属作用的饲料添加剂及鱼、贝类净化或暂养脱重金属专用剂等提供借鉴作用。

[1]励建荣,李学鹏,王丽,等. 贝类对重金属的吸收转运与累积规律研究进展[J]. 水产科学,2007,26(1):51-55.

[2]叶盛权,黄甫. 双壳贝类的净化技术研究[J]. 食品研究与开发,2003,24(4):28-30.

[3]许梓荣. 降低畜禽、水产品重金属残留的纳米饲料添加剂制备方法：中国,2002111101.4. [P]. 2002-10-02.

[4]孙继鹏,汪东风,李国云,等. 壳寡糖钙、镁配合物对栉孔扇贝体内镉的脱除[J]. 中国海洋大学学报,2010,40(2):33-37.

[5]程珊珊. 牡蛎中重金属镉、铅的富集及脱除方法的研究[D]. 湛江:广东海洋大学,2011.

[6]王晓玲,张宾,史周荣,等. 紫贻贝(Mytilusedulis)不同组织对镉的生物富集及释放特征[J]. 食品工业科技,2015,36(19):101-106.

[7]Shi H,Sui Y,Wang X,et al. Hydroxyl radical production and oxidative damage induced by cadmium and naphthalene in liver ofCarassiusauratus[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part C Toxicology & Pharmacology,2005,140(1):115-121.

[8]陈琳琳,张高生,陈静,等. 汞、硒暴露对紫贻贝(Mytilusedulis)抗氧化酶系统的影响[J]. 生态毒理学报,2011,6(4):383-388.

[9]龚朋飞,袁慧. 硒拮抗镉毒性的研究[J]. 兽药与饲料添加剂,2003(6):19-22.

[10]惠天朝,施明华,朱荫湄. 硒对罗非鱼慢性镉中毒肝抗氧化酶及转氨酶的影响[J]. 中国兽医学报,2000,3:264-266.

[11]李小霞,陈锋,潘庆,等. 硒源对凡纳滨对虾生长、体组成和抗氧化能力的影响[J]. 水产科学,2016,3:199-203.

[12]张华,黄克和,薛家宾,等. 不同硒源对兔体液免疫及抗氧化能力影响的研究[J]. 营养学报,2006,28(3):209-212.

[13]Campo VL,Kawano DF,Silva DB,et al. Carrageenans:

biological properties,chemical modifications and structural analysis-a review[J]. Carbohydrate Polymers,2009,77(2):167-180.

[14]袁有宪. 螯合剂EDTA的性质及其在水生生物培养与育苗中的作用[J]. 水产学报,1991,15(3):260-271.

[15]闫锋,赵喜梅,王军林,等. 依地酸钠钙治疗儿童慢性铅中毒55例临床观察[J]. 吉林医学,2010,31(10):1378-1379.

[16]邱毅,杨超敏,陈小红,等. 小剂量EDTA对39例环境镉暴露尿镉超标者驱镉效果观察[J]. 应用预防医学,2012,18(2):113-115.

[17]Hiraoka Y. Reduction of heavy metal content in Hiroshima Bay oysters(Crassostreagigas)by purification[J]. Environmental Pollution,1991,70(3):209-217.

[18]Das S,Jana BB. Dose-dependent uptake and Eichhornia-induced elimination of cadmium in various organs of the freshwater mussel,Lamellidensmarginalis(Linn.)[J]. Ecological Engineering,1999,12(12):207-229.

[19]黄国清. La和Ce对牡蛎Cd吸收和理化指标的影响及其富集规律研究[D]. 青岛:中国海洋大学,2013.

[20]柴茜. 镉锌联合对河南华溪蟹鳃组织的毒性效应研究[D]. 太原:山西大学,2014.

[21]Bagni M,Romano Nfinoia MG,Abelli L,et al. Short-and long-term effects of a dietary yeast beta-glucan(Macrogard)and alginic acid(Ergosan)preparation on immune response in sea bass(Dicentrarchuslabrax)[J]. Fish & Shellfish Immunology,2005,18(4):311-325.

[22]沈文英,阳会军,柯慧芬,等.β-葡聚糖对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响[J]. 水产科学,2007,26(7):381-383.

[23]王忠,聂伟,呙于明,等.β-1,3-D-葡聚糖的免疫调节作用及其机制研究进展[J]. 动物营养学报,2007,19(1):481-486.

[24]李万坤,闫鸿斌,才学鹏,等.β-葡聚糖的免疫增强作用机理研究进展[J]. 中国畜牧兽医,2007,34(7):151-155.

[25]刘群芳,曹俊明,黄燕华,等.β-葡聚糖与硒、维生素E联合添加对凡纳滨对虾组织生化指标及免疫、抗氧化相关酶mRNA表达的影响[J]. 动物营养学报,2013,25(5):1045-1053.

[26]朱连勤. 葡萄糖酸钙抗小鼠铅中毒的作用[A]. 中国畜牧兽医学会动物毒物学分会.中国畜牧兽医学会动物毒物学分会2009年学术研讨会论文集[C].中国畜牧兽医学会动物毒物学分会，2009:1.