不同品种蓝莓发酵酒的抗氧化性研究

李 硕

（上海食品科技学校，上海201599）

蓝莓(Blueberry)属越桔科越桔属(Vacinium)灌木,原产北美[1]。近20年，在美国、加拿大、日本和欧洲的很多国家蓝莓都倍受人们青睐。近年来，我国开始种植蓝莓，并对蓝莓开展研究。近年美国农业部(USDA)和美国国家医学研究院(NIH)着重对蓝莓的营养与保健作用进行了深入研究，结果表明，蓝莓富含抗氧化剂、细菌生长抑制剂、叶酸、花色素苷、类黄酮等化合物，而这些化合物对于人体内自由基的清除、抑制及逆转人体衰老有密切关系[2-3]。随着人们对健康生活的需求越来越高，富含多酚类等抗氧化物质成分的蓝莓成为保健品市场的新宠，蓝莓的生产和深加工引起了生产者和消费者的广泛关注[4]。

在众多的蓝莓加工产品中，蓝莓酒既保留蓝莓果实的营养价值，提高附加值，又作为时尚饮品满足市场的需要。蓝莓酒发酵后具有抗氧化能力，具有较高的营养价值，将逐渐成为蓝莓深加工中的主导产品[5]。Rupasinghe等[6]研究显示，蓝莓酒的总抗氧化能力和总酚含量具有较高水平，酚类物质中的黄酮和酚酸类能够清除人体自由基，赋予了蓝莓酒较强的抗氧化能力。随着蓝莓酒抗氧化性的深入研究，引起了生产者和消费者的广泛关注，研究不同品种蓝莓酒中酚类物质及其抗氧化活性对蓝莓酒的实际生产有着积极的推动作用。因此本文对上海市金山地区种植的6种蓝莓进行发酵，对生产的蓝莓酒的抗氧化能力及其总酚、总黄酮等抗氧化物质含量进行了检测分析，科学评价蓝莓酒的抗氧化活性，为深入开发利用蓝莓酒资源提供理论依据，为金山地区的果酒发展提供借鉴。

表1 蓝莓品种

1 材料与方法

1.1 实验材料

蓝莓由上海市蓝莓研究所提供，见表1。

抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓酒酿造工艺

鲜果清洗➝榨汁➝酶解➝调整➝接种活化好的酵母液➝主发酵（23℃）➝后发酵➝陈酿➝澄清➝过滤➝杀菌➝灌装➝成品

操作要点：调整初始糖度至180 g/L；接种量按照果醪量的0.151‰加入活性干酵母，用蓝莓醪液活化，活化条件为30℃下3 h；发酵至残糖不再明显降低时去除酒脚，下罐。

1.2.2 总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒法

定义：在37℃时，每分钟每毫升酒样使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

计算公式：

其中：30为37℃反应30 min，0.1为取样0.1 mL。1.2.3 总酚测试

总酚测试采用福林酚法[7]，以对羟基苯甲酸作为标准品，每个样品平行测定3次。标准曲线方程为 y=0.0672+0.0011x，r2=0.9804。

1.2.4 总黄酮测试

总黄酮测试，以芦丁作为标准品，采用硝酸-亚硝酸钠比色法[8]，每个样品平行测定3次。标准曲线方程为 y=0.03986+5.7910×10-4x，r2=0.9983。

1.2.5 总三萜皂苷测试

准确称取20.0 mg熊果酸，加入95%vol乙醇溶解并定容至100 mL，配成标准溶液。准确移取标准溶液0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL和3.00 mL于10 mL比色管中，氮吹干。各加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.5 mL，摇匀，再各加高氯酸1.0 mL，摇匀，60℃水浴15 min，取出冷却，加入冰醋酸5.0 mL，摇匀，于548 nm波长处测定吸光度。以熊果酸浓度（或质量）为横坐标（x），吸光度作为纵坐标（y），绘制标准曲线。各取一定体积的待测样品上清液，按上述方法操作。每个样品平行测定3次。标准曲线方程为y=0.04957+5.61145×10-4x，r2=0.9923。

1.2.6 清除DPPH能力测定

参照Brand-William等建立的方法[9]，准确配制浓度为1×10-4mol/L的溶液。移取上述样品提取液0.2 mL，DPPH溶液3.8 mL，以0.2 mL 50%vol乙醇与DPPH反应液为空白。避光反应1 h，517 nm测定吸光度。

因此，各酒样的清除率（%）=（1-A1/A0）×100%。

其中：A1为测试液吸光度，A0为空白对照组的吸光度。

1.2.7 清除ABTS·+能力测定

将7 mmol/L的ABTS溶液和140 mmol/L的过硫酸钾溶液，以500∶88比例混合，避光静止12～16 h，形成墨绿色稳定化合物，作为储备液。将储备液用乙醇稀释至734 nm吸光度0.70±0.02。移取上述提取液0.1 mL，加入3.9 mL ABTS·+工作液3.9 mL，混匀后，静止避光反应6 min，测试734 nm波长吸光度。以0.1 mL 50%vol乙醇和3.9 mLABTS·+工作液吸光度为空白对照A0。

得到各样品的ABTS·+清除率（%）=（1-A1/A0）×100%。

1.2.8 亚铁离子还原能力测定（FRAP）[10-11]

以10∶1∶1混合0.3 mol/L(pH 3.6)的醋酸缓冲溶液，10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L氯化铁溶液。

准确吸取0.1mL系列浓度为0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L和1 mmol/L的硫酸亚铁溶液，与0.3 mL去离子水混合，再加入3.9 mL FRAP溶液，混匀，37℃反应4 min。593 nm测吸光度，绘制硫酸亚铁-吸光度标准曲线。标准曲线方程为y=0.0618+0.000288x，r2=0.9926。

准确吸取0.1 mL上述样品提取液，与0.3 mL去离子水混合，再加入3.9 mL FRAP溶液，混匀，37℃反应4 min，593 nm测吸光度。以硫酸亚铁标准曲线计算出相应的FeSO4浓度，定义为当量浓度（FRAP值）。最终结果表示为每FRAP值越大，表示抗氧化活性越强。

2 结果与分析

2.1 蓝莓酒总抗氧化能力的比较

总抗氧化能力实际上是测定铁离子的还原能力，即将体系中的Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过分光光度计比色测出其抗氧化能力的高低，光吸收值变化越大，总抗氧化能力越强。测试结果见表2。

表2 总抗氧化指标测试结果

从表2可看出，巴尔德温和梯芙兰品种的蓝莓酒总抗氧化能力明显高于其他品种。

2.2 蓝莓酒总酚含量的比较（图1）

近年来很多实验都证实红葡萄酒具有抗氧化性，而其抗氧化性主要来源于其自身所含的酚类物质，总酚含量越高，抗氧化性则越强[12]。酚类物质是强体外抗氧化剂，许多研究证实其有预防心血管疾病、预防癌症等功能，酚类物质的这些功能和其清除自由基金属螯合能力等有直接的关系[13]。

图1 6种品种蓝莓酒总酚含量

图1表明，6种品种蓝莓酒均具有一定量的总酚，其中巴尔德温和梯芙兰蓝莓酒含量较高，分别为1.234 mg/mL±0.026 mg/mL和1.160 mg/mL±0.022 mg/mL，喜来蓝莓酒含量最少，为0.406 mg/mL±0.004 mg/mL。对应的红酒、白葡萄酒、黄酒，其酚类物质的含量分别是1～4 mg/mL、0.2～0.4 mg/mL、0.249 g/mL[14]。蓝莓酒总酚含量接近于红葡萄酒，高于白葡萄酒和黄酒。

2.3 蓝莓酒总黄酮含量的比较（图2）

黄酮类化合物是多酚的主要成分之一，具有清除氧自由基等多种生理活性，在抗氧化、保护视力、延缓衰老、增强免疫力、保护人体免受自由基的损伤等方面起到很好的作用[15]。

图2 6种品种蓝莓酒总黄酮含量

如图2所示，6种品种蓝莓酒均具有一定量的总黄酮，其中巴尔德温蓝莓酒含量最高，含量为1.232 mg/mL±0.025 mg/mL，其次是梯芙兰蓝莓酒，含量为1.010 mg/mL±0.021 mg/mL，喜来蓝莓酒含量最少，为0.216 mg/mL±0.001 mg/mL。

大量实验表明，一些类黄酮物质具有较强的抗氧化性，能抗微生物、螯合金属离子、抑制低密度脂蛋白氧化和肿瘤细胞生长等作用。因此，食物类黄酮物质生物学作用及其机制已成为当今营养与食品科学研究领域的热点之一[16]。因此，研究蓝莓酒中总黄酮的含量，对蓝莓酒的开发具有指导意义。

2.4 蓝莓酒总三萜皂苷含量的比较

三萜皂苷广泛分布于多种植物的根、茎、叶、树皮及花中，资源丰富，具有抗肿瘤、抗衰老及增强免疫力等生理活性，可预防和治疗多种疾病,对开发利用天然资源具有广阔的发展前景[17]。本实验采用比色法测定6种品种蓝莓酒总三萜皂苷含量（图3）。

图3 6种品种蓝莓酒总三萜皂苷含量

如图3所示，6种品种蓝莓酒总三萜皂苷含量最低1.618mg/mL±0.011mg/mL，最高15.229mg/mL±1.003 mg/mL，表明蓝莓酒含有一定量总三萜皂苷，具有抗衰老、增强免疫力等功能。奥尼尔品种蓝莓酒具有较高的总三萜皂苷含量。

2.5 蓝莓酒清除DPPH自由基能力的比较

DPPH自由基在517 nm处有最大吸光值，它能够从释放质子的物质处得到质子，形成一种稳定的反磁性分子[18]。研究表明[19]，释放质子是物质抗氧化能力的机理之一，通过测定物质对自由基的清除能力，可以较迅速地评价物质的抗氧化能力。所以，在517 nm处吸光值会变小，原先稳定的紫色会变浅或成为黄色。吸光值越低表示清除自由基的能力越强。结果见图4。

图4 6种品种蓝莓酒清除DPPH自由基的能力

如图4所示，6种品种蓝莓酒对自由基的清除能力最低为36.78%±3.04%，最高为74.02%±4.87%，这表明蓝莓酒有明显的清除自由基的能力。巴尔德温和梯芙兰蓝莓酒具有较强的清除自由基能力。在体内，若自由基的形成超过人体机能自身保护能力时，就会诱发如动脉粥状硬化等慢性病。蓝莓酒作为一种自由基抑制剂，可以降低自由基在人体中产生的危害。

2.6 蓝莓酒清除ABTS·+能力的比较（图5）

1993年，Miller等[20]首次介绍了用ABTS·+法来测定一些化合物的抗氧化活性。在734 nm处，ABTS·+有特征吸收，利用待测化合物清除ABTS·+引起吸光度变化来评价抗氧化活性[21]。此后，在饮料、一些植物提取物，尤其是葡萄酒中广泛采用ABTS·+法来判断其抗氧化活性[22-23]。

图5 6种品种蓝莓酒清除ABTS·+的能力

如图5所示，6种品种蓝莓酒对ABTS·+的清除能力最低为45.78%±3.28%，最高为83.91%±5.51%，这表明蓝莓酒有明显的清除ABTS·+能力。巴尔德温和梯芙兰蓝莓酒具有较强的清除ABTS·+能力。

2.7 蓝莓酒亚铁离子还原能力的比较

测定蓝莓酒还原力，实质上是检验蓝莓酒中是否含有良好的电子供应体，通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的。还原力越强，则抗氧化性越强。因此可通过测定还原力来说明抗氧化活性的强弱。本试验吸光度越大，FRAP值越大，还原力越强，表示抗氧化活性越强。结果见图6。

图6 6种品种蓝莓酒的亚铁离子还原能力

如图6所示，亚铁离子还原能力：巴尔德温＞梯芙兰＞蓝丰＞佐治亚＞奥尼尔＞喜来。其中，巴尔德温品种的蓝莓酒亚铁离子还原能力为30.72 mmol±2.38 mmol Fe2SO4L/mL酒样。

3 总结

3.1 建立了一个以总抗氧化能力、清除DPPH自由基能力、清除ABTS·+能力、离子还原能力为指标的抗氧化检测体系。根据此体系，对不同品种蓝莓采用相同工艺酿造的蓝莓酒的抗氧化能力进行了初步检测。

3.2 蓝莓酒具有一定的抗氧化能力，不同品种蓝莓酒差异较大，其中巴尔德温和梯芙兰品种抗氧化能力最强。

3.3 蓝莓酒总酚含量：巴德尔温＞梯芙兰＞奥尼尔＞蓝丰、佐治亚＞喜来，其总酚含量范围为0.406～1.234 mg/mL，接近于红葡萄酒，高于白葡萄酒和黄酒。

3.4 蓝莓酒总黄酮含量：巴德尔温＞梯芙兰＞蓝丰＞佐治亚＞奥尼尔＞喜来，其总黄酮含量范围为0.216～1.232 mg/mL，接近于红葡萄酒，高于白葡萄酒和黄酒。

3.5 蓝莓酒的总酚、总黄酮对其抗氧化能力有正相关性，也进一步说明蓝莓酒中的多酚物质是蓝莓酒抗氧化作用的重要物质基础。

3.6 蓝莓酒含有一定量总三萜皂苷，具有抗衰老、增强免疫力功能。其中奥尼尔品种含量最高，为15.229 mg/mL。

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