峨眉岩白菜根叶的三萜含量及活性分析

罗思源，曾 辰，冯士令，陈 涛，周莉君，丁春邦

(四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安，625000)

峨眉岩白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)是虎耳草科(Saxifragaceae)岩白菜属(Bergenia)多年生草本植物，该属植物总计10余种，主要分布于东亚、南亚北部和中南亚，其中峨眉岩白菜为我国特有种，分布于四川西南地区[1-2]。岩白菜始载于清《分类草药性》，为民间常用药，其根状茎和全草可入药，具有抗菌、消炎、止咳、祛痰等功能，并有促进病变组织恢复的作用，是治疗慢性支气管炎、支气管哮喘等呼吸系统疾病的特效药物[3]。

岩白菜属植物中的主要活性成分为岩白菜素，在根部分布较多[4-5]。目前研究多集中于对岩白菜素的化学修饰及相关药理活性研究，忽略了对其他活性成分的研究[6-8]。有报道指出岩白菜中含有多糖、黄酮类、蒽醌类、氨基酸类和三萜类等物质[9-12]，陈蕉等人从岩白菜中提取出多糖和黄酮提取物并发现其具有一定的抗氧化活性[13]。而岩白菜中的三萜成分鲜有报道，仅从新疆厚叶岩白菜中定性发现含有三萜化合物的存在[12]，并没有做深入的含量测定和提取等方面工作。

三萜类是由6个异戊二烯聚合而成的一类化合物，在植物体内主要以苷的形式存在。现已从植物体中提取出较多的三萜类化合物，如人参皂苷、甘草苷、灵芝三萜等。三萜类化合物具有抗肿瘤[14]、抑菌[15]、促进免疫等多种活性[16]。从金银花中提取出的总三萜被证实具有较好的抑菌活性，对常见致病菌的最小抑菌浓度为3～24 mg/mL[17]，且三萜类化合物对K562、SW620、L1210以及Hep G2等多种癌细胞均具有较好的抑制活性[18-19]。岩白菜已被证实含有三萜类化合物，但并没有相关文献报道其是否具有一定的抗氧化、抗肿瘤等生物活性。

本试验以我国特有物种峨眉岩白菜为研究对象，比较根和叶提取物中三萜含量并进一步探究其体外抗氧化和抗肿瘤活性，为峨眉岩白菜的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料

供试材料采自四川峨眉山海拔1300～1500 m 地区，由四川农业大学胡超副教授鉴定为峨眉岩白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)。将根和叶分别用超纯水清洗3遍，50℃恒温烘干至恒重，粉碎过60目筛，干粉-20℃储存备用。

1.1.2 仪器与试剂

BT-124S电子天平(德国Sartorius公司)；RM-220实验室超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)；DNP-9082电热恒温培养箱(上海三发科学仪器有限公司)；RE-2000B旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器)；AIR TECH超净工作台(苏净集团安康公司制造)；Spectra Max M2酶标仪(美国Molecular Devices公司)。

2, 2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)购自美国Sigma公司；熊果酸标准品、抗坏血酸(Vc)、乙醇、冰乙酸、高氯酸、香草醛购自成都科龙化工试剂厂；DMEM高糖培养基、消化酶、青霉素-链霉素(双抗)购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibico公司；CCK-8试剂购自武汉博士德生物公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

取50 g根、叶粉末分别溶于1.5 L 80%乙醇，温度45℃、超声功率210 W提取45 min，将提取液抽滤三次，旋转蒸发浓缩滤液，冷冻干燥4 d，得峨眉岩白菜根、叶三萜提取物。

1.2.2 三萜含量测定

采用高氯酸显色法测定三萜含量[17]。将三萜提取物用80%乙醇溶解，取50 μL样液加入100 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和200 μL 高氯酸，混匀后60℃水浴15 min，再加入650 μL冰乙酸，混匀，静置5 min，于550 nm处测定吸光值。用标准品熊果酸制作标准曲线，将样品吸光值带入标准曲线中计算三萜含量。

1.2.3 体外抗氧化活性测定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力测定 根据Blois方法测定DPPH自由基清除能力[20]。30 μL不同浓度样液与170 μL DPPH乙醇溶液(0.8 mM)混匀，遮光反应15 min，在517 nm处测定吸光值。抗坏血酸(Vc)作为阳性对照。DPPH自由基清除率根据公式(1)计算：

DPPH自由基清除率(%)=1-A1/A0

(1)

式中A0为无水乙醇代替样品的吸光值，A1为样品处理组的吸光值。

1.2.3.2 总还原能力测定 根据阮士龙等的方法测定总还原能力[21]。0.2 mL样液与0.5 mL PBS(0.2 M)和0.5 mL 1%铁氰化钾溶液混匀，50℃水浴加热20 min，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，0℃冷却5 min。取上清液0.5 mL加入0.1 mL 0.1%氯化铁溶液，在700 nm处测定吸光值。吸光值越大表明总还原能力越强。

1.2.4 细胞毒性和抑癌活性测定

1.2.4.1 细胞培养

HEK-293T细胞、A549细胞由四川农业大学生命科学学院生物工程系惠赠。Hela细胞和CHO细胞购自上海中科院细胞库。四种细胞用含有1%双抗的DMEM高糖培养基培养(含10%胎牛血清)，放于含5% CO2的37℃培养箱中培养。每隔2 d用胰蛋白消化酶将细胞从培养瓶底消化下来并进行传代。

1.2.4.2 细胞毒性测定

将根、叶三萜提取物用DMSO溶解成相应浓度。HEK-293T和CHO细胞用消化酶消化后离心获得细胞沉淀，用培养基重悬细胞至细胞浓度为5×104个/mL，96孔板中每孔加入90 μL细胞悬浮液，37℃培养12 h后加入10 μL样液(DMSO终浓度<0.5%)。培养24 h和48 h，将培养基吸出，加入100 μL新鲜培养基和10 μL CCK-8试剂，培养30 min，在450 nm处测定吸光值。细胞活力根据公式(2)计算：

细胞活力(%)=A1/A0

(2)

式中A0为空白组吸光值，A1为样品处理组吸光值。

1.2.4.3 细胞抑制率测定

Hela细胞和A549细胞用消化酶消化后1200 r/min离心2 min，弃上清液，加入新鲜培养基重悬细胞，再次离心2 min后弃上清并加入新的培养基。调整细胞浓度为5×104个/mL，96孔板中每孔加入90 μL细胞悬浮液，边缘用100 μLPBS液体填充，培养12 h后加入10 μL样液(DMSO终浓度<0.5%)。37℃培养24 h和48 h后弃培养液，加入新鲜培养基100 μL和10 μL CCK-8试剂，放置30 min后在450 nm处测定吸光值。细胞抑制率根据公式(3)计算：

细胞抑制率(%)=1-A1/A0

(3)

式中A0为空白组吸光值，A1为样品处理组吸光值。

1.3 统计分析

所有试验均进行4次独立重复，试验结果以平均值±相对误差(mean±SD)表示。试验数据统计分析及作图采用Graphpad Prism 6.0 软件。P<0.05认为具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 三萜含量比较

吴红红等人曾用显色法定性检测出岩白菜中含有三萜类化合物，但没有定量分析其含量[12]。本试验将峨眉岩白菜根、叶三萜提取液旋转蒸发浓缩后测定其三萜提取物中总三萜含量，从表1中可以看出峨眉岩白菜根部三萜提取物中三萜含量较高为49.81%，叶中含量较少为14.19%。表明峨眉岩白菜总三萜含量较高，且根部三萜含量高于叶，可以作为一种三萜化合物的来源。常霞等人从金银花中提取出三萜类化合物含量为3.71%[17]。王维等人发现青钱柳中总三萜含量在0.20%～0.79%之间[22]。可以看出峨眉岩白菜根和叶中总三萜含量远高于其他植物中总三萜含量，因此可以作为一种天然三萜化物来源。

表1 不同部位提取物三萜类物质含量

2.2 体外抗氧化活性比较

陈翠等人发现岩白菜乙醇提取物具有较好的自由基清除能力，其活性为VE的两倍[23]。而关于峨眉岩白菜的其他相关抗氧化活性研究报道甚少。从图1A中可以看出根、叶三萜提取物均能较好的清除DPPH自由基，浓度达到0.6 mg/mL之后，根三萜提取物对DPPH自由基清除能力与Vc相当，最大清除率为93.16%，IC50为0.28 mg/mL；浓度达到0.8 mg/mL之后，叶三萜提取物对DPPH自由基清除能力与Vc相当，最大清除率为90.44%，IC50为0.34mg/mL。从图1B中可以看出，随着浓度升高，根、叶三萜提取物的吸光值升高，表明总还原能力增强，符合浓度剂量效应，且根三萜提取物在1 mg/mL浓度下总还原能力与Vc相当。结果表明，峨眉岩白菜三萜类化合物具有较强的体外抗氧化能力。

2.3 细胞毒性比较

从图2中可以看出峨眉岩白菜根、叶三萜提取物对HEK-293T和CHO细胞均有不同程度的毒性。根三萜提取物在小于50 μg/mL浓度下对HEK-293T细胞的增殖无显著影响(图2A)，在小于100 μg/mL浓度下对CHO细胞增殖抑制能力在10%以内(图2C)。因此根三萜提取物在100 μg/mL浓度细胞毒性较小。叶三萜提取物浓度小于100 μg/mL时对HEK-293T细胞增殖无显著影响(图2B)，浓度小于400 μg/mL时对CHO细胞增殖抑制能力在10%以内(图2D)，因此叶三萜提取物在400 μg/mL浓度细胞毒性较小。因根中三萜含量远高于叶中(表1)，所以根三萜提取物对两种正常细胞的最小毒性浓度均小于叶三萜提取物。在800 μg/mL时，根、叶三萜提取物对两种细胞的增殖抑制达到90%，因此在后面的抑癌试验中舍去800 μg/mL浓度。

图1 不同部位三萜提取物体外抗氧化活性比较Fig.1 The antioxidant ability comparison of triterpenes extracts from different parts注：(A)DPPH自由基清除能力(B)总还原能力

图2 不同部位三萜提取物细胞毒性Fig.2 The side effects of triterpenes extracts from different parts on cells注：(A)根三萜提取物对HEK-293T细胞毒性(B)叶三萜提取物对HEK-293T细胞毒性(C)根三萜提取物对CHO细胞毒性(D)叶三萜提取物对CHO细胞毒性。ns表示没有显著性，*表示p<0.05.

2.4 抑癌活性比较

2.4.1 抑制A549细胞能力

用药处理24 h和48h后，400 μg/mL浓度的根三萜提取物对A549细胞增殖有显著的抑制能力，高达50%，在25～200 μg/mL浓度之间对A549细胞的抑制能力均在20%以内(图3A)。但400 μg/mL浓度下，根三萜提取物对HEK-293T和CHO细胞的抑制率达到80%，出现了细胞毒性，因此根三萜提取物在该浓度下对A549细胞的抑制能力可能是由于其具有一定的细胞毒性引起的。用400 μg/mL浓度的叶三萜提取物处理48 h后，A549细胞的增殖受到一定的抑制作用，抑制率为20%左右(图3B)。400 μg/mL的叶三萜提取物细胞毒性较小(图2B、2D)，因此叶三萜提取物在该浓度下对A549表现出一定的抑制能力。虽高浓度三萜提取物对A549细胞的增殖有较好的抑制能力，但高浓度的三萜提取物有一定的细胞毒性，可能是由于细胞毒性而导致的抑癌活性。而低浓度提取物细胞毒性低，对A549细胞也有一定的抑制能力，抑制率在20%左右。因此峨眉岩白菜三萜类化合物对A549肺癌细胞有一定的抑制能力。

图3 不同部位三萜提取物对A549细胞抑制能力Fig.3 The inhibition effects of triterpenes extracts from different parts on A549 cells注：(A)根三萜提取物对A549细胞抑制能力(B)叶三萜提取物对A549细胞抑制能力

2.4.2 抑制Hela细胞能力

从图4A中可以看出，在100 μg/mL时根三萜提取物对Hela细胞的增殖有明显的抑制作用，处理48h后，抑制率达到90%。叶三萜提取物处理48h后，400 μg/mL浓度下对Hela细胞抑制能力达到50%，虽然抑制能力较根三萜提取物弱，但也能显著抑制Hela细胞的增殖，且符合浓度剂量效应(图4B)。在细胞毒性较小的浓度下，根三萜提取物对Hela细胞的抑制率高达90%，叶三萜提取物对Hela细胞的抑制率高达50%，因此峨眉岩白菜三萜提取物对Hela细胞表现出极强的抑制能力。刘素君等人用峨眉岩白菜乙醇提取物处理移植性S180实体荷瘤小鼠后，发现能显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达52.11%[24]。本试验的结果也表明，峨眉岩白菜三萜提取物对A549和Hela细胞均具有较强的抑制能力，与之前的文献报道相符合。

图4 不同部位三萜提取物对Hela细胞抑制能力Fig.4 The inhibition effects of triterpenes extracts from different parts on Hela cells注：(A)根三萜提取物对Hela细胞抑制能力(B)叶三萜提取物对Hela细胞抑制能力

3 结论

峨眉岩白菜根部及叶均含有三萜类物质，其中根部三萜提取物中三萜含量较高，经浓缩干燥后三萜含量可达49.81%。体外抗氧化活性试验结果表明根、叶三萜提取物均具有较强的体外抗氧化能力，对DPPH自由基具有较强的清除能力。铁氰化钾还原力试验表明随着浓度增加，三萜提取物总还原能力增强，符合浓度剂量效应。体外细胞试验结果表明根三萜提取物在100 μg/mL浓度下细胞毒性较低，叶三萜提取物在400 μg/mL浓度下细胞毒性较低。在细胞毒性较小浓度下，根叶三萜提取物均对A549肺癌细胞有一定抑制能力，对Hela细胞有较强抑制能力。由此可知，峨眉岩白菜中三萜含量较高，根叶三萜提取物具有较强的抗氧化能力与抗肿瘤活性，其中，根部三萜提取物三萜含量较高，抗氧化、抑癌活性较好。因此，峨眉岩白菜可以作为一种三萜类化合物来源，可开发为一种新型的抗氧化剂或者抗肿瘤药物。