上饶地区开展血液核酸筛查应用情况

邱筱椿，王玲玲

(上饶市中心血站，江西 上饶 334000)

目前，临床输血治疗是一种无法替代的治疗手段，有时甚至是抢救生命的首要和必要手段。但是，输血传播病毒是临床输血安全最大的隐患，尽管采用血清学检测技术已使输血传播疾病的风险得到有效的降低，但仍存在检测“窗口期”较长、病毒滴度低、免疫静默性感染和病毒变异等因素，使临床输血安全依然存在一定的风险[1]。因为病毒感染人体后会依次经历复制、转录或反转录、翻译3个阶段。血液筛查使用的酶联免疫（ELISA）技术，只能检测病毒翻译表达的产物——蛋白质（即抗原或抗体），而对前2个阶段的产物——核酸却无能为力。核酸扩增技术（NAT）具有高灵敏度和特异性及低污染风险的特点。不仅弥补了常规酶联免疫技术的缺点，而且作为酶联免疫检测技术的补充可进一步降低输血残余风险，显著缩短血液感染病毒的检测“窗口期”。为了进一步提高血液质量的保证输血安全，本血站于2014年7月对献血者血液筛查标本开展高灵敏的核酸检测 （NAT）技术。初步探讨NAT应用于本地区无偿献血者血液筛查的必要性。现将2015年1月-2016年8月献血者血液标本检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2015年1月-2016年8月本血站采集的无偿献血者的血液标本，献血者均符合国家 《献血者健康检测要求》，经体检和快速筛查（HBsAg、抗-TP、ALT）合格后采集的血液标本共54750例，每位献血者采集血液同时留取3管血液标本，第1管5ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于常规ELISA和ALT的检测，第2管3ml用EDTA-K2抗凝的真空采血管用于血型检测，第3管5ml用无菌、无DNA酶、无RNA酶带惰性分离胶的EDTA-K2抗凝的BD真空采血管用于核酸（NAT）检测，其中NAT检测标本采集后用低温冷冻离心机3000r/min离心20min后与2-8℃冰箱保存，并与72h内完成检测。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂 ELISA检测试剂，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP检测试剂盒由厦门英科新创科技有限公司和北京万泰生物药业股份有限公司提供，ALT检测试剂盒由上海荣盛科技有限公司和上海科华有限公司提供，乙肝两对半试剂盒由厦门英科新创科技有限公司提供.核酸检测试剂.罗氏 Cobas TaqScreen MPx V2.0 HBV、HCV、HIV NAT联合检测试剂盒由美国罗氏诊断公司提供，所有试剂均严格按试剂盒说明书要求进行操作，并在有效期内使用。

1.2.2 主要仪器 ELISA检测使用，Hamilton STAR全自动加样仪和FAME酶免分析仪 （瑞士HAMILTON公司），ALT检测使用，日立7020全自动生化分析仪（日立公司）。核酸检测使用罗氏诊断Cobas’S201血液核酸筛查平台：Hamilton STAR全自动样仪 （瑞士 HAMILTON公司），Cobas Ampiprep核酸提取仪和Cobas Taqman Ama Lyier核酸扩增检测仪通过混样和数据管理服务器(PDM)连接组成血筛平台。

1．3 检测流程

1．3．1 常规检测 所有献血者标本均按照国家 《献血者健康检查要求》进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、ALT、血型的全项检测，由不同的检测人员，采用2种不同厂家的试剂，使用不同的检测仪器进行2遍全项的平行检测，严格按试剂盒说明书进行操作和判定结果，当标本HBsAg/抗-HCV/抗-HIV/抗-TP/ALT 2种试剂检测结果均为反应性判为不合格，2种试剂检测结果均为无反应性则判为合格，若只有一种试剂检测为反应性的则用该试剂对原血样做双孔复试，双孔复试结果均为无反应性的结果判合格，双孔复试结果中任何1孔为反应性的结果判为不合格。抗-HIV为反应性的样本送HIV确认实验室进行确证，所有试验均按试剂盒说明书在实验室管理软件中编定程序，自动判读结果。

1．3．2 核酸检测 对常规检测合格标本做核酸（NAT）检测，采用罗氏 Cobas TagScreen MPx Test Version 2.0二代试剂，由全自动混样仪自动混样，每 6份标本（167ul/份）混成 1份（1ml）作为一级混样池（PooL）标本，由全自动核酸提取和全自动核酸扩增仪进行HBV-HCV-HIV NAT检测，每批检测均设置1个阴性质控和5个阳性质控（HIV-1 M组 RNA 、HIV-1 O 组 RNA、HIV-2 RNA、HCV RNA、HBV DNA）。每个PooL均含有内对照，如果混样PooL的检测为无反应性，则6份标本结果为合格，如果混样PooL检测结果为反应性，对该PooL中6份标本进行拆分检测，单样本拆分检测结果作为该样本最终检测结果，单样本的最终拆分检测可直接区分报告HIV、HCV和HBV病毒为反应性。

1．3．3 NAT阳性献血者的血清学补充试验 目前本血站NAT检测阳性只发现HBV DNA阳性结果，对HBV DNA阳性标本做乙肝两对半检测。

2 结果

2.1 2015年1月至2016年8月共采集献血者标本54750例，其中输血传染性指标血清学检测合格标本为54049例，不合格标本为701例，不合格率为1.28%，具体见表1。

2.2 核酸检测标本54049例，共检出HBV DNA阳性139例，阳性反应率为0.26%，具体见表2。

表1 54750例献血者血清学检测结果情况

表2 ELISA阴性标本NAT检测结果

2.3 139例HBV DNA检测阳性标本经乙肝两对半检测结果共有6种模式分别以A-F表示，具体见表3。

表3 139例HBV DNA阳性标本乙肝两对半检测模式

3 讨论

本血站献血者输血传染性指标血清学检测的不合格率为1.28%，低于抚州地区4.12%（1631/39599）[2]、新余市 3.78%（1706/45078）[3]和娄底地区3.92%（2427/61929）[4]，这主要是本血站在献血者采血前的初筛检测中做了HBsAg、抗-TP和ALT的快速检测有关。对常规检测合格的54049例标本进一步用NAT技术检测，检出139例阳性标本，阳性检出率为0.26%，与南昌地区的0.24%（194/79414）[5]和龙岩地区的 0.24%（47/19922）[6]很接近，明显高于乌鲁木齐市的0.11%（62/57644）[7]和常州地区的0.10%（19/17220）[8]。此139例阳性标本均为HBV DNA阳性，未检出HCV RNA阳性和HIV RNA阳性标本（0/54049）原因分析：可能是①本地区为HCV和HIV的低流行区，②常规ELISA两种试剂组合互补有效的检出了HCV和HIV抗体阳性的标本，③HBV是DNA病毒对外界环境的抵抗力较强，而HCV和HIV均为RNA病毒，这与RNA的生物学特性有关[9]，RNA为单链病毒，不稳定容易分解和变异，④由于开展NAT检测时间不长，标本量不够大，所以未检测出HCV RNA和HIV RNA阳性标本。表3结果显示，应用ELISA方法检测HBsAg阴性而NAT检测HBV DNA阳性的139例标本乙肝两对半结果，其中HBcAb阳性占92.08%，HBcAb和HBeAb同时阳性的占41.7%，此现象的发生有可能为HBsAg急性感染的窗口期，亦可能为既往感染过HBV或是急性感染的恢复期，也可能为基因突变形成新的变异株。

终上所述，本次调查表明本地区仍属我国HBV相对的高流行区，而且隐匿性感染和窗口期的HBV是目前本地区影响酶免阴性血液安全的主要因素，NAT检测能有效的筛查出ELISA检测合格为HB-sAg无反应性的HBV感染标本，是确保血液安全的另一种有效的检测手段。NAT检测能将窗口期大大缩短[1，10]，其中 HBV 为 6-15d，HCV 为 41-60d，HIV为10-15d。所以在献血者血液检测中以ELISA结合NAT检测在方法学上有很好的互补性，《血站技术操作规程（2015）版》已明确输血相关传染病的检测项目及检测方法，必须用核酸检测技术进行HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA检测。采供血机构应选择合适的核酸检测系统，加强操作人员的培训，严格遵守操作规程，做好仪器设备的日常维护保养工作及试剂性能确认管理，保证核酸检测结果的有效性，有效地提高输血安全，保障临床用血安全。

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