偏头痛的五羟色胺1A受体(5-HTR1A)基因-1018C/G启动子区多态性位点分析

许贤平，易飞

(萍乡市人民医院神经内科，江西 萍乡337000)

偏头痛属于神经内科常见病，是临床上发病率较高的一种血管性头痛，该病具有病程长、易复发等特点，对患者健康及生活质量的影响极大。临床上通常将偏头痛分为先兆性与无先兆性偏头痛两种。现阶段临床上尚未明确该病发生的主要因素，通常认为其和遗传及环境等多种因素有关，部分学者认为多个微效基因联合作用构成了其遗传易感性[1]。现阶段临床上尚未发现偏头痛的致病基因，仅可见部分易感基因。五羟色胺（5-HT)及其受体和偏头痛有较大关联。5-HTR1A基因存在5q11.2-q13区，其中基本无内含子。随着研究的深入，临床上在启动子区检测到该基因-1018C/G多态性位点，具有较多的遗传信息[2]。为了解偏头痛的基因多态性位点情况，本研究对收治的156例偏头痛患者及138例健康对照组人员进行了对比分析，详细报告如下。

1 对象和方法

1.1 研究对象

1.1.1 病例组 选取2014年1月到12月期间在江西萍乡市人民医院就诊的156例偏头痛患者，所有患者均为汉族，患者均符合相关诊断标准[3]，其中男68例，女88例；患者年龄最小17岁，最大59岁，平均年龄（36.98±12.54）岁；

1.1.2 正常对照组 选取同期在我院进行健康体检的138例健康体检者为对照组，其中48例为男性，90例为女性，年龄最小18岁，最大55岁，平均（35.29±11.47）岁，病例组与对照组患者临床资料无较大差异（P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 所有患者均采集静脉血5ml，同时进行抗凝处理，然后提取DNA，提取方法均采用常规酚/氯仿抽提法，标本采集后30min内红细胞破膜，取肝素抗凝外周血5ml装入50ml离心管中，加3倍体积的红细胞裂解液混匀，在4℃环境下静置30min。在溶液透明后3000r/min离心10min，去除清液在沉淀中加入2ml的细胞核裂解液，混合均匀之后加入200μl浓度为20%的SDS，在粘稠透明后加入20μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，在37℃恒温摇床消化过夜。次日依次加等体积的Tris饱和酚，以3000r/min下离心处理10min后，加入等体积三氯甲烷，以3000r/min下离心处理10min后，将上部清液转移到另一个15ml的无菌离心管中。加入2倍体积的无水乙醇，摇匀后可见白色絮状DNA析出。

1.2.2 PCR扩增 位点分析以聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)计数为主，PCR反应体系为20ul中含100ngDNA，上游引物为5，-TGG AAGAAGACCGAGTGTCTAC-3，下游引物 5，-TCT CCCTGGGAGAGTAAGGCTGG-3，上下游引物各0.5uM，dNTPs 200uM，MgCl21.5mM，1×PCR buffer溶液及0.5u的TapDNA聚合酶。PCR反应条件为：95℃变性 5min； 然后以 95℃变性 45s，56℃复性45s，72℃延伸 45s，循环反应 35次；最后 72℃延伸10min。PCR扩增产物为182bp的DNA片段，取10ul PCR产物加4u HpyCH4Ⅳ内切酶，于37℃条件下进行酶切6h，2%琼脂糖凝胶电泳及溴化乙锭染色，最后鉴定基因型。

1.2.3 扩增条带检测 由于-1018C→G单碱基置换使HpyCH4Ⅳ限制性位点消失，故消化产物出现182bp则表明携带突变型-1018G，出现158bp、24bp则表明携带野生型-1018C。由于实际电泳时24bp条带难以显示，出现182bp一条带代表GG基因型，出现182bp、158bp两条带代表CG基因型，出现158bp一条带代表CC基因型。

图1 5-HTR1A基因-1018C/G位点PCR产物酶切后琼脂糖凝胶电泳图

1.2.4 统计方法 本研究数据均采用SPSS 18.0统计学软件研究，计数资料组间差异检验进行卡方检验，并进行Hardy-Weinberg平衡分析，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 病例组患者χ2=0.398，df=2，P=0.819， 对照组则分别为 0.090、1、0.956，两组5-HTR1A基因-1018C/G位点的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明两组患者样本基因型均可独立表达总体。

2.2 基因频率分布 (表1)对比两组等位基因频率无统计学意义(χ2=0.028，df=1，P=0.868)。

表1 5-HTR1A基因-1018C/G多态性等位基因与基因型分布

3 讨论

偏头痛是临床上发病率较高的一种原发性头痛类型，该病患者的主要临床表现为发作性中重度、搏动样头痛为主，疼痛时间通常可持续4-72h，部分患者可见恶心、呕吐等症状，对患者健康的影响极大[4，5]。由于偏头痛较为复杂，这也就加大了致病基因检测的难度。候选基因关联分析是临床上较为常用的一种遗传研究方式，其主要是将单核苷酸多态性（SNP）作为一串标记，对疾病和标记间的关联进行研究，进而达到筛选易感基因效果的一种方式[6，7]。随着研究的深入，临床上通常认为偏头痛的易感性研究候选基因为5-HT受体基因[8]。国外研究显示5-HT 1A转运体基因可导致疾病易感性加大，并认为其和偏头痛的发生有较大关联[9，10]。

Kusumi在117例日本偏头痛和360例对照者中对5-HTR2C基因23号外显子多态位点cys23ser进行分析，发现ser等位基因频率较对照组高，提示cys23ser增加日本群体的疾病易感性[11]。-1018C/G是5-HTR1A基因启动子区的SNP，可影响基因的转录和受体的表达，可作为偏头痛易感基因的筛选位点[12，13]。

我们通过对156例偏头痛患者和138例对照者进行PCR-RFLP分析发现，5-HTR1A基因–1018C/G多态性位点等位基因和基因型频率在两组中分布无明显差异，与Ates研究者在土耳其人群中，对比分析203例偏头疼患者和202例对照者中基因多态性位点分析结论一致[12]。5-HTR1A基因-1018G等位基因频率在汉族群体中为22.5%，而西班牙人为53.5%，不同种族间存在有较为明显的不同，这说明该位点具有一定的种族特异性，故而必须要在其他人群中展开更加深入的研究[7]。有研究显示，MO患者中具有5-HT1A受体的超敏感性，预防偏头痛的药物可经由5-HT1A受体起到一定的预防功效，这就表明，该受体与偏头痛的发生有较大关联[14，15]。

总而言之，虽然1018C/G位点可在一定程度上对5-HTR1A基因的转录造成影响，但其并不表明5-HTR1A基因-1018C/G是导致偏头痛发生的主要危险因素，临床上仍需加大研究力度，开展更加深入的探究。

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