肝炎、肝硬化、肝癌患者血清干扰素-γ水平的变化及意义

欧阳博慧，谢晴晴，王林春，孙一帆

(1、柳州市中医医院检验科，广西 柳州 545001；2、柳州市柳铁中心医院检验科，广西 柳州 545007)

人感染乙型肝炎病毒（HBV）后的临床转归差异巨大，如不积极治疗，病情将不断进展，肝脏发生纤维化，最终导致肝硬化和肝功能衰竭，HBV的慢性感染也是原发性肝癌诸多致病因素中最主要的致病因素之一。乙型肝炎的发病与机体的免疫反应有关，细胞因子是一类由单核巨噬细胞、淋巴细胞等分泌的具有调节细胞功能的多肽物质，在机体的免疫反应中与乙肝病毒相互作用，相互影响[1]。干扰素家族是一类具有抗病毒活性的细胞因子。其中干扰素γ（IFN-γ）属于细胞因子中的一种，是病毒感染机体后，由细胞分泌的具有抗病毒功能的宿主特异性糖蛋白，是一种重要的巨噬细胞激活因子。IFN-γ通过与细胞表面干扰素受体（IFNGR）结合，诱导多种抗病毒蛋白的产生，从而使病毒感染细胞内产生抗病毒作用，使病毒无法进一步损伤宿主细胞[2]。IFN-γ还能通过干扰细胞周期，抑制细胞增殖。其基因多态性可能通过影响IFNγ的表达和分泌改变机体调节的抗病毒和免疫反应，从而影响疾病的发生发展[3]。IFN-γ的这种抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节特性，在肝炎、肝硬化、肝癌的发生发展过程中，参与了多种生理病理过程，并在其中发挥了关键作用[4]。本研究通过测定血清中的IFN-γ水平在肝炎、肝硬化、肝癌患者中血清学水平差异，为其应用在肝炎、肝硬化、肝癌的早期治疗和早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究为病例－对照研究。研究对象来源于2016年6月至10月在柳州市中医医院体检者和住院患者。正常对照组173例。病例组共347例，其中慢性乙型肝炎（CHB）129例、乙肝后肝硬化（LC）63 例、肝癌（HCC）患者 155 例。

1.1.1 对照组纳入标准 ⑴无肿瘤或者肝脏、肾脏、内分泌、心脑血管等重大疾病史；⑵血清指标：乙型肝炎表面抗原 （HBsAg）、乙型肝炎 e抗体（HBeAb）和乙型肝炎表面核心抗体（HBcAb）阴性；甲胎蛋白(AFP)正常；血常规和生化指标正常。纳入者为体检中心健康体检者。

1.1.2 CHB组纳入标准 根据《慢性乙型肝炎防治指南》2015更新版拟定的标准[5]，本研究中CHB组纳入标准为HBsAg和HBV DNA阳性且既往有乙型肝炎病史或HBsAg阳性超过6个月的病人。若发病时间不明，可根据病人症状、生化指标、肝组织学检查及其它临床和辅助结果进行判断。

1.1.3 乙肝后LC组纳入标准 HBsAg阳性，或HBV DNA阳性，或有明确的乙型肝炎病史。有肝功能异常、有门脉高压临床表现或肝硬化的影像学表现，肝穿刺病理结果有假小叶形成者可直接确诊为LC。

1.1.4 HCC组纳入标准 根据《原发性肝癌诊疗规范（2017年版）》[6]及2004年版《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[7]：⑴AFP≥400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并能触及肿大、坚硬及有大结节状肿块的肝脏或影像学检查有肝癌特征的占位性病变者。⑵AFP<400μg/L能排除妊娠、生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物（DCP、GGTⅡ、AFU 及 CA19-9等）阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变者。⑶有肝癌的临床表现并有肯定的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其中发现癌细胞)并能排除转移性肝癌者。本研究遵循伦理学原则，所有研究对象自愿参与，均已知情同意。

1.2 仪器与方法

1.2.1 标本收集 清晨空腹抽取每个研究对象静脉血3ml装入无抗凝剂的红色帽的无菌干燥管内，室温放置30min后，3000r/min转离心10min，取血清保存于-80℃冰箱中，用于血清IFN-γ水平检测。

1.2.2 测定原理 用ELISA方法进行血清中IFN-γ浓度。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗IFN-γ抗体的微孔中依次加入标本或标准品，生物素化的抗IFN-γ抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物显色。底物在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中IFN-γ呈正比。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD)值，根据用标准品绘制的标准曲线，计算样本浓度。

1.2.3 测定步骤 ⑴配制标准品：将标准品用1ml样本稀释液溶解，充分混匀即为标准品原液。依次进行倍比稀释得到其余6个标准品浓度。以样本稀释液为空白。⑵将配制好的8个浓度标准品、样本加入反应板孔中。每孔加 100μl。37℃温育 2h。弃去液体，甩干，每孔加生物标记抗体工作液100μl，37℃温育1h。弃去孔内液体，甩干，在洗板机上洗板9次后，每孔加入HRP标记亲和素工作液100μl，37℃温育 1h。 弃去孔内液体，甩干，在洗板机上洗板9次后，每孔加入底物90μl，37℃避光显色，当肉眼可见标准品有明显的蓝色梯度时，每孔加入终止液50μl，终止反应。反应终止后5min内在酶标仪上，用450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。⑶标准曲线绘制和结果计算：在试剂盒厂家网站上下载专业软件“Curve Expert 1.4”。根据提示制作标准曲线。根据样本OD值，由标准曲线查出相应浓度。

1.2.4 所用试剂和仪器 使用人IFN-γ酶联免疫试剂盒（96T/盒，cusabio生物科技有限公司，美国）。使用仪器为美国BioTek公司酶标仪 （型号：ELX800）。批内精密度CV%＜8%；批间精密度CV%＜10%。试剂盒自带质控水平一和水平二，操作步骤同上。

1.3 统计学处理 本研究中的数据处理：计量资料如果符合正态分布，采用平均值±标准差表示（x±s），多组比较采用单因素方差分析（One-Way ANO-VA）；若不符合正态分布，采用中位数（四分位间距）M（IQR）表示，组间比较用 Kruskal-Wallis检验。统计检验使用双侧概率检验，以P＜0.05时认为结果有统计学意义。数据用SPSS 12.0进行数据分析。

2 结果

2.1 各组研究对象人口学资料 本研究中的研究对象一般性资料见表1。经卡方检验，四组间男女构成比差异无统计学意义（P=0.758）。经方差分析，四组间年龄差异无统计学意义（P=0.959）。

表1 各组研究对象人口学资料

2.2 对照组、CHB组、LC组、HCC组血清中IFN-γ浓度 四组IFN-γ浓度数据以均值±标准差 （x±s）表示，见表2采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA）检验进行四组样本比较。四组血清中IFN-γ浓度比较差异有统计学意义 （F=9.606，P<0.001）。两两比较结果表明，HCC组和对照组比较差异有统计学意义 （F=37.110，P<0.000），LC 组和对照组比较有统计学意义（F=29.638，P=0.012），其它组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 对照组、CHB组、LC组、HCC组血清中IFN-γ浓度

3 讨论

虽然目前HCC详细的发病机制尚未完全明确，但公认的免疫细胞功能异常和细胞因子失衡是HCC发病机制之一。机体免疫系统在HBV感染后被激活，免疫细胞释放多种细胞因子，进而形成一个复杂的免疫调节网络。IFN-γ是乙肝相关性HCC发病过程中重要的细胞因子，主要由激活的CD4+、CD8+T细胞和自然杀伤细胞产生，T细胞既可以作为免疫效应细胞直接杀伤靶细胞，又可以作为免疫调节细胞调节免疫应答[8]。IFN-γ是重要的Th1类细胞因子，是Ⅱ型干扰素的唯一成员[9]，可以激活并调节CD8+细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic CD8+T-lymphocytes，CTL)和肥大细胞。 然而，IFN-γ水平与肝脏疾病之间的关系尚未完全阐明。已有研究发现IFN-γ可以通过清除病毒的衣壳颗粒及其病毒基因组、使病毒RNA失稳等途径发挥直接抑制HBV复制的作用，在先天性和获得性宿主免疫反应中发挥着重要作用[10]。我们的结果表明，血清中IFN-γ在研究组中浓度呈不同水平分布，对照组血清中IFN-γ水平明显高于病例组，HCC组血清中IFN-γ水平最低。因此，IFN-γ血清学水平可能是一个有价值的肝病检测指标。

我们的结果提示，HCC患者中IFN-γ水平明显降低。据调查研究统计，初次感染HBV的成人中，90%~95%能够依靠自身免疫系统清除病毒而表现为自限性感染或无症状感染，仅5%~10%的感染者发展为慢性肝炎。因此，IFN-γ主要在病毒感染初期发挥作用。而在长期的炎症过程中，其水平会受到其它细胞因子，尤其是Th1类细胞因子的影响，如IL4、IL10、转化因子β能抑制IFN-γ的产生[11]，这可能是病例组尤其是HCC组IFN-γ水平低于对照组的原因。此外，IFN-γ能够抑制病毒增殖，调控细胞凋亡，其水平可能与肝脏疾病的严重性相关。如Attallah AM等[12]发现IFN-γ水平与肝纤维化程度、白蛋白、血小板计数、总胆红素和国际标准化比率（INR）之间存在显着的关联，IFN-γ参与了乙肝、肝硬化、肝癌等肝病的发病过程，IFN-γ高水平有利于病毒清除和感染的恢复，而低水平的IFN-γ有利于病毒逃逸，使病毒持续复制导致慢性化感染。研究发现，IFN-γ的表达受基因调控，其血清水平的改变影响HBV清除[3]。另有研究表明，其水平的高低在一定程度上也能够反映肝细胞损害的严重程度，其参与了肝脏炎性损伤过程，与肝炎病情轻重密切相关[1]。目前关于肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中IFN-γ水平差异，各项研究结果并不统一。甘雪婷等[13]测定了48例肝硬化、40例原发性肝癌和20例正常对照者血清中的IFN-γ水平，结果表明肝癌组IFN-γ水平低于肝硬化和正常对照组，这与我们的结果相似，但我们的研究表明肝癌组和肝硬化组IFN-γ水平并无明显区别。陈焰等[14]检测了30例慢性肝炎和30例肝癌患者的血清标本，发现慢性肝炎组和原发肝癌组IFN-γ水平轻度升高，与对照组比较无显著性差异。Meng等[15]发现23例肝癌患者IFN-γ水平与正常对照组无明显区别，但经肝移植后，IFN-γ水平明显上升。陶鹏辉[16]的研究表明，CHB、LC、PHC三组患者之间血清IFN-γ水平比较无显著差异，但与健康对照组比，IFN-γ水平明显增高。标本量不同可能是造成结果不一致，甚至相反的主要原因。

IFN-γ基因多态性会影响到IFN-γ的表达。有研究表明，IFN-γ基因+874位点与IFN-γ基因中的CA重复序列相关，TT基因型中CA重复12次，干扰素产量最高[17]。如Saxena R等[18]的研究结果认为HCC组血清中IFN-γ水平最高，其次为对照组；且多重回归分析结果表明基因型显著影响IFN-γ表达。Arababadi MK等[19]的研究结果发现肝炎组血清中IFN-γ水平要高于对照组，且IFN-γ水平与基因型明显相关，TT基因型的IFN-γ水平明显要高于在AA基因型中的水平。在我国，IFN-γ＋874T/A位点存在基因多态性，在人群中以突变AA基因型为主，占60%以上，其次为TA杂合子，野生型TT基因型所占比例不到10%[20，21]，与国外人群相比，存在明显的差异[18，22]。广西是一个少数民族聚居的地方，我们以前的研究也表明[23]，广西人群的IFN-γ的TT基因型比例明显低于其它种族。可见，基因背景不同也可能是造成结果不一致的原因之一，特别是作为IFN-γ高产量的TT基因型所占比例影响较大。

综上所述，慢性HBV感染是一个由多种免疫细胞和细胞因子参与的复杂过程，各种免疫细胞和细胞因子间相互影响、调节和制约。IFN-γ血清学水平在不同的肝病中呈现不同程度的表达。但应注意到其基因多态性也会对血清学水平产生影响，因此，结合血清学和基因检测，可能是一个有价值的肝病检测指标。我们将进一步扩大标本量，并结合甲胎蛋白等检测指标，对IFN-γ应用于肝病检测的特异性和灵敏度进行进一步研究。

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