利用环介导恒温扩增16S rRNA对无乳链球菌快速鉴定的新方法

肖伟强，潘军，姚新伟，常彦敏，孙明月，许青霞，周丽莉

(郑州大学附属肿瘤医院检验科，河南 郑州 450000)

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是 B组链球菌 (Group B Streptococcus，GBS)唯一的一个种，是造成孕产妇生殖道感染的重要原因，严重时更可引起泌尿系感染、绒毛膜羊膜炎、产褥感染、新生儿感染等[1，2]。目前无乳链球菌的检测方法有传统培养、乳胶凝集实验、免疫层析、实时荧光定量PCR和环介导恒温恒温扩增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的方法等。LAMP 由日本科学家Notomi发明[3]，反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下 （60～65℃），可在15~60min内实现109~1010倍的扩增，最后形成具有颈环结构长短不一的多个双链DNA。LAMP扩增效率高，操作简单，特异性强，底物检测方便，广泛用于细菌类病原微生物的现场检测。无乳链球菌特异性靶基因主要有cfb基因、16S rRNA、16S-23srRNA基因的间隔区和scpB和ssrA基因等[4]。BLAST比对证明无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA相似度超过95%，仅在个别位点有差异，引物设计较难，因此很少有人把16S rRNA作为LAMP扩增GBS的靶基因。本文欲在此设计引物，一方面来探讨以16S rRNA为靶基因来检测GBS的可行性，另一方面来检验LAMP方法对序列极其相似的靶基因的区分能力。

1 材料与方法

1.1 菌株及来源 无乳链球菌标准菌株55191购自ATCC，其余52株无乳链球菌和其他131株非无乳链球菌（包括化脓链球菌12株、停乳链球菌停乳亚种11株、停乳链球菌似马亚种23株、马链球菌6株、咽峡炎链球菌10株、粪肠球菌20株、中间链球菌3株、牛链球菌4株、屎肠球菌26株、金黄色葡萄球菌7株、铅黄肠球菌9株）均来自我室不同时期临床的分离株。所有无乳链球菌、停乳链球菌停乳亚种、停乳链球菌似马亚种均再次经过16S rRNA通用扩增测序后比对确证，方法见文献[5]。

1.2 仪器与试剂 Bst DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker、细菌总DNA提取试剂盒均购自大连宝生物，金属浴和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司，引物合成由上海生工技术有限公司完成，其他试剂均购自日本Takara公司。

1.3 LAMP引物设计 选择无乳链球菌16s rRNA参考基因 NR_040821.1、NR_113262.1、NR_115728.1、NR_117503.1，软件DNAMAN7.0比对，选择的序列为无乳链球菌的保守区，停乳链球菌的可变区。Primer Explorer(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)在线设计共4条引物：正向外部引物F3，反向外部引物B3，和带有互补序列的正向内部引物FIP和反向内部引物BIP，具体位置和序列详见图1。

图1 LAMP引物位置及序列

1.4 LAMP扩增的反应体系 反应体系 25μl，包括：10xBst buffer 【20mMpH 为 8.8 的 Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton-100】，25mM MgCl2，2.5mM dNTPs，5M betaine，内引物(FIP 和 BIP)，外引物(F3 和 B3)，Bst DNA 聚合酶，DNA 模板，ddH2O，SYBR Green I。 结果判读采用自然光显色、荧光显色和2%琼脂糖凝胶电泳分析的方法。

1.5 LAMP扩增的条件优化 首先固定LAMP反应体系中 FIP/BIP引物的浓度为 1.6μM，F3/B3为0.4μM，模板 2μl，Bst DNA聚合酶最佳反应温度60℃，然后逐一分别配制梯度浓度的dNTPs、betaine、镁离子，各自采用不同的反应时间，根据反应产物琼脂糖凝胶电泳的结果对LAMP反应体系中的以上变量进行优化。

1.6 LAMP扩增特异性检测 用优化后的LAMP方法对52株无乳链球菌和131株非无乳链球菌进行扩增，计算假阴性和假阳性。

1.7 LAMP扩增敏感性检测 将无乳链球菌55191接种于 Luria-Bertani培养基，37℃培养 18~24h[6]，取100μl菌液进行平板计数，之后，将菌液做101~106倍6个梯度的稀释，煮沸法提取细菌基因组DNA，分别取 2μl做 LAMP和 Real Time PCR检测，比较两种方法的灵敏度。

2 结果

2.1 LAMP扩增条件优化 根据琼脂糖凝胶电泳条带的亮度，最终确定25μl反应体系中dNTPs、betaine、镁离子分别为 0.6mM、1.0M、12mM，最佳反应时间为60min。

2.2 特异性检测 仅52株无乳链球菌产生梯度条带，其他细菌（包括34株停乳链球菌）均无任何条带（图 2）。

图2 部分无乳链球菌和停乳链球菌LAMP扩增结果

2.3 敏感性检测 经平板菌落计数，原始菌液浓度为3.8×105cfu/ml。将原始菌液做101~106倍6个梯度的稀释，相同方法提取基因组DNA，分别取2μl做PCR和LAMP检测，结果显示，LAMP能检出104倍的稀释，而普通PCR仅能检出102倍的稀释，前者比后者的灵敏度高出近100倍（图3）。

图3 无乳链球菌敏感性检测

3 讨论

16S rRNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其分子大小适中，存在于所有的生物中，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称，因此根据细菌16S rRNA可变区的差异可以用来区分不同的菌，目前已成为细菌种属鉴定的标准方法[7]。但16S rRNA序列在原核生物中的高度保守性，对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差，特别是在某些菌属中，16S rRNA有时差异很小，这就给LAMP引物设计带来难度，所以目前仅有军团菌等少数细菌的LAMP检测试剂盒的靶基因为16S rRNA[8]，其余LAMP检测试剂盒多在特异性功能蛋白基因上，或者变异度更大的16S-23S rRNA间隔区(Intergen ic Spacer Region，ISR)[9]。美国 Yanhong Liu[10]开发了一种环介导恒温扩增的方法来区分停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌，他利用16s-23s的间隔区设计了三组引物，分别识别这三种细菌，证明环介导恒温扩增的方法时间短，灵敏度高，能识别0.1pg的目标底物的模板。本文在16S rRNA处设计引物，克服了种间序列区分的难度，也成功区分了上述细菌，并且具有很高的敏感性和特异性，证明LAMP对GBS检出的可行性；而且，与Yanhong Liu等人的方法相比，本文更加简单方便，在16S rRNA处设计引物，可用于任何细菌，比选择单纯的功能性蛋白基因或其他特异性基因，具有更好的通用性。

LAMP扩增的特异性与其引物设计有很大关系。本课题中，引物靶基因参考了Genbank数据库中6条无乳链球菌16S rRNA的参考基因，并且尽量选择了其保守区，但相对停乳链球菌则位于最大变异区，所以能有效区分无乳链球菌和停乳链球菌。本文的52株无乳链球菌均能产生梯度条带，其他细菌包括停乳链球菌均无任何条带，说明本方法对仅有个别碱基差异的16S rRNA也能有效区分，具有很好的特异性。

LAMP扩增的敏感性方面，本文证实每ml低至40个菌落即可检出，显示出其超高的敏感性。McKenna JP等人利用LAMP技术扩增GBS的sip基因，证明具有100%的特异性，并能检出最少14各拷贝的基因[11，12]；日本 Kimura[13]也曾利用环介导恒温扩增的方法来扩增GBS的cfb基因，证明这种方法在恒温的条件下能发现4个拷贝的模板基因，结合本文的实验证实，LAMP方法对无乳链球菌的检测具有准确、高效、灵敏等特点。但随之而来的，LAMP扩增的高灵敏性带来了不可避免的缺点是假阳性高，因此，尽可能所有反应均在单一闭合管中进行，避免开盖污染。本文即在上盖中，预加入SYBR Green I，待反应结束后上下混匀显色，能有效避免污染。

本文的LAMP扩增优化的条件在1h内完成，有人在4条引物的基础上设计了一对环状引物，能大大加快反应速度，在30min内既能完成检测，大大降低了LAMP现场检测的要求[14，15]。对于本文环状引物的适用，还需要进一步研究。

总之，本文设计的在16S rRNA处扩增无乳链球菌具有很高的灵敏度和特异性，能有效区分序列高度近似的停乳链球菌和无乳链球菌。如果利用可随身携带的实时荧光检测仪，就能在床边完成对无乳链球菌快速、简单、随机的操作，具有很大的市场前景。

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