四引物法快速检测白细胞介素1A基因3'UTR插入/缺失多态性

贾二娟 ，吴梦怡 ，柴丽娜 ，余乐涵 ，万福生 ，朱伟锋

(1、许昌市中心医院检验科，河南 许昌 461000；2、南昌大学医学部第一临床医学院，江西 南昌 330006；3、南昌大学医学实验教学部，江西 南昌330006；4、南昌大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，江西 南昌 330006)

作为IL-1家族的一个重要成员，白细胞介素1A（interleukin-1A，IL-1A）在免疫调节和炎症反应中都发挥着十分重要的作用。位于IL-1A基因3'非翻译区（untranslated region，UTR）的“TTCA”四碱基插入/缺失 （insertion/deletion，Ins/Del） 多态性（rs3783553） 可影响 IL-1A mRNA 和蛋白表达[1，2]，从而可能与肝癌[1]、鼻咽癌[2]、口咽癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]、卵巢上皮癌[6]、子宫内膜癌[7]、宫颈癌[8]、脑胶质瘤[9]、斑秃[10]、骨关节炎[11]等的发病相关。目前该位点的检测方法中，有的操作较复杂，有的成本较高，所需时间较长，因此有必要建立一种快速、简便、低成本的rs3783553检测方法。

四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应 （tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，T-ARMS-PCR） 是在等位基因特异性PCR基础上建立起来的一种单核苷酸 多 态 性 （single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型方法[12]。T-ARMS-PCR对SNPs的分型只需要四条普通引物，PCR扩增后直接进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳时条带出现的位置即可判断基因型，已被广泛用于SNPs和突变的研究[13-16]。目前还没有T-ARMS-PCR法对rs3783553检测的报道。因此，如果针对rs3783553设计四条引物，可能会实现该多态性位点的快速、简便、低成本检测。

1 对象与方法

1.1 研究对象 100例血样由在许昌市中心医院体检的100名志愿者（均知情同意，其中男性59名，年龄27～65岁，女性41名，年龄27～70岁）提供。每位志愿者抽取静脉血2ml，EDTA抗凝。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 使用天根全血DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA[17]。根据超微量紫外分光光度计定量结果，取部分DNA稀释为10ng/μl，作为PCR扩增模板。

1.2.2 PCR扩增 使用T-ARMS-PCR引物设计软件 （http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html） 设 计rs3783553分型的四条引物，上游外引物：5'-GCAG ACAGTGTTTTCTGGGATAAGTAAG-3'，下游外引物：5'-TGGTCTGATCACAATTTTTAGAACCTAGA-3'，缺失型内引物：5'-CTGGGCATTCTTGTTTCAAT TTCA-3'，插入型内引物：5'-ACTTGATTGCAGGTG GAATTGACTG-3'。其中上游外引物与下游外引物配对可得到352bp的共有PCR产物，上游外引物与插入型内引物配对可得到插入型等位基因对应的236bp的PCR产物，缺失型内引物与下游外引物配对可得到缺失型等位基因对应的157bp的PCR产物。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。 PCR 反应体系为 10μl， 包含 5μl 2×Taq master mix（上海近岸科技有限公司），10μmol/L 上下游引物各0.2μl，10μmol/L缺失型内引物和非缺失型内引物各 0.6μl，模板 1.0μl，ddH2O 2.4μl。 使用朗基MG96G PCR仪进行扩增。PCR条件：94℃预变性 3min；94℃变性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35个循环；最后72℃延伸5min。

1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 PCR完成后取PCR产物4μl在2%琼脂糖凝胶上（含溴化乙锭0.5ug/ml）电泳，150V 30min后凝胶成像系统拍照。

1.2.4 DNA测序 随机选取10例在琼脂糖凝胶电泳表现为不同带型的样本扩增后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。PCR反应体系为20μl，包含 10μl 2×Taq master mix，10μmol/L 上下游引物各 0.4μl，模板 1.0μl，ddH2O 8.2μl。PCR 条件：94℃预变性 3min；94℃变性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35个循环；最后72℃延伸5min。

2 结果

2.1琼脂糖凝胶电泳结果 图1为6例样本rs3783553的T-ARMS-PCR分型电泳图。从图中可知，rs3783553的T-ARMS-PCR产物有3种情况：出现236bp和352bp的Ins/Ins基因型，出现157bp和352bp的Del/Del基因型，出现157bp、236bp和352bp的Ins/Del基因型。100例样本中Del/Del基因型39例，Ins/Ins基因型10例，Ins/Del基因型51例。

图1 rs3783553的T-ARMS-PCR分型电泳图

2.2 DNA测序结果 DNA测序结果（图2）显示在琼脂糖凝胶电泳表现为236bp和352bp的都是rs3783553的Ins/Ins基因型（图2-A），在琼脂糖凝胶电泳表现为157bp和352bp的都是rs3783553的Del/Del基因型（图2-B），在琼脂糖凝胶电泳表现为 157bp、236bp和 352bp的都是 rs3783553的Ins/Del基因型 （图2-C），与T-ARMS-PCR法对rs3783553的分型结果完全一致。

图2 rs3783553不同基因型样品测序图

3 讨论

研究表明，IL-1A基因是miR-122的靶基因之一。IL-1A基因3'UTR区DNA序列可显著影响miR-122与其的结合。rs3783553的Ins等位基因破坏了miR-122与IL-1A的结合，从而增加了IL-1A的转录活性，发挥抗肿瘤效应[1]。Meta分析也认为该多态性与我国汉族人口癌症易感性相关，其中Ins等位基因可能是中国汉族人群的保护因素，而Del等位基因则可能是癌症易感因素[18]。也有研究认为该多态性还与肿瘤的复发相关[19]。

就rs3783553的检测方法来说，目前主要有聚合酶链反应-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polymerase chain reaction-polyacrylamide gel electrphoresis，PCR-PAGE）法[1-10]、DNA 直接测序法[11]、TaqMan 探针法[20]等。PCR-PAGE是目前rs3783553检测最常用的方法，其最大的优点是一次可对较多样本进行检测，成本较低。但该方法需要配制聚丙烯酰胺凝胶，电泳结束后还需要染色、漂洗、显色等步骤，操作较复杂。DNA直接测序法是检测DNA序列的金标准，但需要昂贵的设备，成本较高。TaqMan探针法能够简便的对rs3783553进行检测，但引物需要修饰，因此成本较高。此外也需要用到昂贵的设备。

从图 1可知，Ins/Del基因型的 157bp、236bp的特异性片段的亮度相当，表明PCR的体系合适。Ins/Ins基因型的352bp共有片段很弱，可能是因为插入型内引物与上游外引物的结合影响了上游外引物和下游外引物的结合。Ins/Del基因型的352bp片段较Del/Del基因型的352bp稍弱也说明了这一点。本研究中三种基因型的分布与北京[1]、江苏[1]、大连[11]等正常人群中基因型的分布接近和DNA测序与T-ARMS-PCR法的分型结果完全一致都证明了本方法的可靠性。Delvaux等用T-ARMSPCR、PCR-RFLP、TaqMan探针和DNA直接测序的方法对IL-28B基因上的两个SNPs进行了分析，结果表明T-ARMS-PCR方法的成本效益比最好，而且快速、简便，不需要特殊的设备，适合在发展中国家使用[15]。

总的来说，本研究建立的四引物检测IL-1A基因3'UTR插入/缺失多态性的方法，是一种能在普通实验室开展的操作简便、快速、低成本的检测方法。

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